卵巢癌患者外周血Th17/Treg 細(xì)胞的檢測(cè)及其臨床意義

邵素芳 于春美 (山東省濰坊市益都中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，濰坊 262500)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，雖然發(fā)病率低于宮頸癌和宮體癌，但致死率卻占各類婦科腫瘤的首位。卵巢癌早期癥狀不典型，早期診斷困難，尚缺乏有效的治療手段。目前卵巢癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與內(nèi)分泌、遺傳、精神及機(jī)體免疫功能等因素有關(guān)。輔助性T 細(xì)胞17(T help cell 17，Th17)/調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)是新近發(fā)現(xiàn)的兩種CD4+T 細(xì)胞亞群，機(jī)體正常狀態(tài)下，Th17/Treg 細(xì)胞之間保持平衡，參與了機(jī)體的免疫應(yīng)答及免疫耐受，而Th17/Treg 細(xì)胞失衡在炎癥反應(yīng)、移植物抗宿主反應(yīng)、自身免疫性疾病及腫瘤中起重要作用［1-5］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究證實(shí)Treg細(xì)胞在卵巢癌患者體內(nèi)數(shù)量、功能異常，可能與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［6-8］。有關(guān)Th17 細(xì)胞與卵巢癌的研究較少，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌患者的腫瘤組織中Th17 細(xì)胞數(shù)量增加［9，10］。為了進(jìn)一步研究Th17/Treg 細(xì)胞在卵巢癌中作用，本研究檢測(cè)了卵巢癌患者外周血中Th17/Treg 細(xì)胞百分率、相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子retinoid-related orphan receptor gamma-t(RORγt)/foxhead winged-helix box protein 3(Foxp3)mRNA 的表達(dá)及血漿中相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素17(Interleukin-17，IL-17)/轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)的水平，旨在了解Th17/Treg 細(xì)胞在卵巢癌中的變化并初步探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及樣本收集 收集2013 年10 月至2014 年5 月期間在濰坊市益都中心醫(yī)院婦產(chǎn)科住院手術(shù)治療的卵巢癌患者55 例，年齡34～72 歲，平均年齡(56.84±14.26)歲，所有病例均經(jīng)病理證實(shí)為上皮性卵巢癌，其中漿液性囊腺癌32 例，黏液性囊腺癌20 例，內(nèi)膜樣癌2 例，透明細(xì)胞癌1 例。根據(jù)2000 年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(FIGO)修訂的卵巢癌臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期6 例，Ⅱ期15 例，Ⅲ期27 例，Ⅳ期2 例。所有病例排除感染、自身免疫性疾病及嚴(yán)重心肝腎疾病，采集樣本前未進(jìn)行手術(shù)、化療及免疫治療。同期女性健康體檢者60 例為正常對(duì)照組。無菌采取抗凝靜脈血5.0 ml，2 000 r/min 離心10 min 分離血漿，-20℃保存?zhèn)溆?，利用淋巴?xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，用于流式細(xì)胞和RNA 提取。

1.2 主要試劑 FITC 標(biāo)記鼠抗人CD4 抗體、Alexa Fluor?647 標(biāo)記鼠抗人IL-17 抗體、PE 標(biāo)記鼠抗人FoxP3 抗體購(gòu)自美國(guó)BD 公司，TRIZOL 液購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自立陶宛Fermentas公司，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ反應(yīng)液購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，人IL-17、TGF-β1 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D 公司。

1.3 主要儀器 流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD 公司產(chǎn)品，型號(hào)為BD FACS calibur;熒光定量PCR 擴(kuò)增儀為美國(guó)Bio-Rad 公司產(chǎn)品，型號(hào)為Bio-Rad iQ5 Real Time PCR;冷凍高速離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf 公司產(chǎn)品，型號(hào)為Eppendorf 5804R。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 Th17 細(xì)胞檢測(cè) 調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞懸液濃度至1 ×106ml-1，取100 μl 細(xì)胞懸液，加入PMA(終濃度100 ng/ml)、離子霉素(終濃度500 ng/ml)刺激4 h 后，加入蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(終濃度1 μl/ml)。加入10 μl FITC-CD4 抗體進(jìn)行細(xì)胞表面染色，避光孵育30 min 后洗滌細(xì)胞，加入2 ml 固定液孵育20 min，洗滌細(xì)胞后加入2 ml 破膜液孵育30 min 后，洗滌細(xì)胞加入10 μl Alexa Fluor?647-IL-17 抗體后孵育20 min，洗滌重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.2 Treg 細(xì)胞檢測(cè) 調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞懸液濃度至1 × 106ml-1，取100 μl 細(xì)胞懸液，加入10 μl FITC-CD4 抗體進(jìn)行細(xì)胞表面染色，避光孵育30 min后洗滌細(xì)胞，分別加入固定液、破膜液孵育洗滌細(xì)胞，加入10 μl PE-Foxp3 抗體，孵育20 min，洗滌重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.3 RORγt/Foxp3 mRNA 水平檢測(cè) 分離單個(gè)核細(xì)胞，利用TRIZOL 液提取細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA 鏈合成，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)、合成RORγt、Foxp3 及內(nèi)參GAPDH 引物，具體序列如下:RORγt 5'-CAGAGCCAAGGCTCAGTCAT-3'，5'-CCTCACAGGTGATAACCCCG-3'，產(chǎn)物大小103 bp;Foxp3 5'-CACTGCTGGCAAATGGTGTC-3'，5'-GTTTCCATGGCTACCCCACA-3'，產(chǎn)物大小380 bp;GAPDH 5'-GAGAAGGCTGGGGCTCATTT-3'，5'-AGTGATGGCA TGGACTGTGG-3'，產(chǎn)物大小231 bp。采用50 μl 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增:SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ反應(yīng)液20 μl、上下游引物各2.0 μl、cDNA 4.0 μl、雙蒸水22 μl。反應(yīng)條件:95℃20 s 預(yù)變性，95℃5 s、60℃20 s、72℃30 s，共45 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后自動(dòng)獲得擴(kuò)增曲線和循環(huán)閾值(CT 值)，mRNA 的相對(duì)表達(dá)用2-ΔΔCT表示，其中ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt (目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)-對(duì)照組ΔCt(目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)。

1.4.4 血漿中IL-17/TGF-β1 水平檢測(cè) 利用人IL-17、TGF-β1 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測(cè)血漿中IL-17/TGF-β1 水平，每個(gè)樣本做3 個(gè)復(fù)孔，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌患者及正常對(duì)照組外周血中Th17/Treg細(xì)胞百分率的比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示卵巢癌患者外周血中CD4+IL-17+/CD4+T 細(xì) 胞 百 分 率 為(1.29±0.31)%，與正常對(duì)照組(0.81±0.19)%相比明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖1A。與正常對(duì)照組(9.17±2.95)%相比，卵巢患者外周血CD4+Foxp3+Treg/CD4+T 細(xì)胞百分率(12.48±3.35)%顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖1B。

2.2 卵巢癌患者及正常對(duì)照組外周血中RORγt/Foxp3 mRNA 水平的比較 RORγt/Foxp3 是Th17/Treg 細(xì)胞發(fā)育和成熟的關(guān)鍵調(diào)控因子［11-14］，我們采用熒光定量PCR 檢測(cè)了RORγt/Foxp3 mRNA 的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:卵巢癌患者外周血中RORγt/Foxp3 mRNA 表達(dá)水平分別為(0.43±0.22，0.54±0.26)，與正常對(duì)照組外周血RORγt/Foxp3 mRNA 表達(dá)水平(0.31±0.14，0.39±0.17)相比顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖2。

2.3 卵巢癌患者及正常對(duì)照組血漿中IL-17/TGFβ1 水平的比較 IL-17/TGF-β1 是Th17/Treg 細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)的主要分子［15-17］，我們利用ELISA 檢測(cè)了血漿中IL-17/TGF-β1 的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，卵巢癌患者血漿中IL-17/TGF-β1 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，具體見表1。

圖1 卵巢癌患者及正常對(duì)照組外周血中Th17/Treg 細(xì)胞百分率的比較Fig.1 Compare of percentage of Th17/Treg cells in peripheral blood between patients with ovarian cancer and normal controls

圖2 卵巢癌患者及正常對(duì)照組外周血中RORγt/Foxp3 mRNA 水平的比較Fig.2 Compare of mRNA expression of RORγt/Foxp3 in peripheral blood between patients with ovarian cancer and normal controls

表1 卵巢癌患者及正常對(duì)照組血漿中IL-17/TGF-β1 水平的比較(±s)Tab.1 Compare of plasma levels of IL-17/TGF-β1 between patients with ovarian cancer and normal controls (±s)

表1 卵巢癌患者及正常對(duì)照組血漿中IL-17/TGF-β1 水平的比較(±s)Tab.1 Compare of plasma levels of IL-17/TGF-β1 between patients with ovarian cancer and normal controls (±s)

Note:Compared with normal controls，1)P ＜0.05.

3 討論

Th 細(xì)胞前體在抗原的刺激下分化成Th0 細(xì)胞，Th0 細(xì)胞在不同細(xì)胞因子、抗原及抗原提呈細(xì)胞等因素的作用下可以分化成不同的CD4+T 細(xì)胞亞群，1995 年Sakaguchi 等［18］首次證實(shí)Treg 是一群具有免疫抑制作用的CD4+T 細(xì)胞亞群，在自身免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤和移植免疫中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌、肺癌、胰腺癌、胃腸道腫瘤等實(shí)體瘤及血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者外周血及腫瘤組織內(nèi)Treg 細(xì)胞數(shù)量明顯增多，抑制機(jī)體抗腫瘤免疫，促進(jìn)了腫瘤發(fā)生發(fā)展［5，19，20］。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者外周血中Treg 細(xì)胞百分率增高，這與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果基本一致，提示Treg 細(xì)胞參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展［6-8］。Th17 細(xì)胞是在研究自身免疫性疾病過程中逐漸被發(fā)現(xiàn)的，目前普遍認(rèn)為Th17 細(xì)胞是一群獨(dú)立的CD4+T 細(xì)胞亞群。盡管研究證實(shí)Th17細(xì)胞在炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，但關(guān)于Th17 細(xì)胞與腫瘤關(guān)系的研究較少且有爭(zhēng)議，Th17 細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用還是抑制腫瘤作用尚存在爭(zhēng)議［21-24］。國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者的腫瘤組織中Th17 細(xì)胞增多，且Th17 細(xì)胞的數(shù)量與疾病的分級(jí)分期有關(guān)［9，10］。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了卵巢癌患者外周血中Th17 細(xì)胞的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者外周血中Th17 細(xì)胞百分率增多，與Th17 細(xì)胞在腫瘤組織中的結(jié)果基本一致。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究證實(shí)RORγ/tFoxp3 是Th17/Treg 細(xì)胞發(fā)育和成熟的關(guān)鍵調(diào)控因子［11-14］，在Th17/Treg 細(xì)胞的發(fā)育和功能維持中發(fā)揮重要作用，而IL-17/TGF-β1 是Th17/Treg 細(xì)胞的主要效應(yīng)分子［15-17］。為了進(jìn)一步證實(shí)卵巢癌患者外周血中Th17/Treg 細(xì)胞的變化，我們還檢測(cè)了外周血中RORγt/Foxp3 mRNA 水平及血漿中IL-17/TGF-β1水平，發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者外周血中RORγt/Foxp3 mRNA 水平及血漿中IL-17/TGF-β1 水平均增高，與Th17/Treg 細(xì)胞百分率變化一致。綜合我們及國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果推測(cè)［6-10］:卵巢癌患者無論是外周血還是腫瘤組織局部Th17/Treg 細(xì)胞數(shù)量均明顯增高，Treg 細(xì)胞主要通過在外周和腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮免疫抑制作用來發(fā)揮促腫瘤效應(yīng)，而Th17 細(xì)胞主要是通過分泌IL-17 發(fā)揮促炎癥反應(yīng)和促腫瘤血管生成來促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

綜上所述，卵巢癌患者外周血中Th17/Treg 細(xì)胞數(shù)量增多，參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程。進(jìn)一步研究Th17/Treg 細(xì)胞在卵巢癌發(fā)病的不同時(shí)期的變化及二者之間的關(guān)系，將有助于全面了解卵巢癌患者機(jī)體的免疫狀態(tài)，為卵巢癌的治療提供新的策略。

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