CHOP 方案治療前后外周T 細胞淋巴瘤患者外周血CD45RA+ T 和CD45RO+ T 的變化特點①

呂學文 王 博 李揚秋 (暨南大學血液病研究所，廣州 510632)

外周T 細胞淋巴瘤(PTCL)是起源于成熟細胞或稱胸腺后細胞的惡性腫瘤，CHOP 方案常用于其一線治療。細胞免疫功能缺陷是腫瘤形成的一大原因，我們前期研究發(fā)現PTCL 患者外周血中CD4+的比例明顯降低，CD8+的比例明顯升高，CD4+CD45RO+細胞明顯降低，而CD4+CD45RA+細胞比例明顯升高，考慮PTCL 病人胸腺近期輸出功能仍較強［1］。為了進一步了解CHOP 方案化療后病人的初始T 細胞和記憶T 細胞的變化情況，我們增加了樣本量，并分析化療前后初始T 細胞和記憶T 細胞的變化，目的在于了解化療對初始T 細胞和記憶T 細胞的影響，探討其對臨床治療及預后的檢測意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集廣東省農墾中心醫(yī)院2011 年5 月～2014 年6 月經組織形態(tài)學和免疫組化確診的初治PTCL 患者20 例，其中男11 例，女9 例，年齡16～72 歲，平均年齡為(47.90±18.30)歲，均符合PTCL 診斷標準［2］，10 例正常對照組均為健康體檢者，排除第二腫瘤及其他疾病，其中男5 例，女5 例，年齡39～61 歲，平均年齡(50.40±7.86)歲。一般情況比較，差異無統計學意義(P ＞0.05)，具有可比性。

1.2 治療方法 20 例新確診的PTCL 患者其中Ⅱ期7 例，Ⅲ期5 例，Ⅳ期8 例，均采用標準CHOP 方案化療:環(huán)磷酰胺750 mg/m2d1，表柔比星75 mg/m2d1，長春新堿1.4 mg/m2d1，潑尼松60 mg/m2d 1 -5，21 d 為1 個療程。第1 療程結束后病情穩(wěn)定者繼續(xù)給予CHOP 方案化療，化療周期數為4 個周期，并于第1 療程前及第4 療程結束后分別抽取外周肝素抗凝血。

1.3 實驗方法 取PTCL 患者化療前后與正常對照組外周肝素抗凝血，每個標本檢測2 管，均取標本100 μl，一管加入抗 CD4-FITC、CD45RA-PE、CD45RO-PEcy5 單克隆抗體標記各20 μl，另一管加入CD8-FITC、CD45RA-PE、CD45RO-PEcy5 單克隆抗體標記各20 μl，同型對照分別為IgG1-FITC，IgG1-PE，IgG1-PEcy5，混勻，避光孵育25～30 min。加入紅細胞裂解液2 ml 混勻，室溫避光孵育15 min，直至液體澄清透明，1 000 r/min 離心5 min，棄上清。加入2 ml PBS 洗滌液混勻，1 000 r/min 離心5 min，棄上清。將細胞懸浮于0.5 ml PBS 洗滌液中，振蕩混勻后上機檢測。Beckman 公司EPICS-XL型流式細胞儀獲取樣本，CellQuest 軟件進行分析。

1.4 療效評價 根據WHO 實體瘤療效評價標準將治療效果分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)、進展(PD)。四療程治療結束后進行療效評價，化療客觀有效定義為CR +PR，化療無效定義為SD +PD。毒性反應按WHO 化療藥物毒性反應分度標準分為0～Ⅳ度。

1.5 統計學處理 全部數據均經SPSS13.0 統計軟件分析，計算各組均數與標準差，用±s 表示，兩組均數采用獨立樣本t 檢驗，多組均數采用單因素方差分析及LSD 兩兩比較，以P ＜0.05 為差異有顯著性的界限。

2 結果

2.1 療效及不良反應分析 CHOP 方案治療20 例PTCL 患者近期療效分析，完全緩解(CR)6 例、部分緩解(PR)9 例、穩(wěn)定(SD)1 例、進展(PD)4 例。客觀有效率為75%，化療無效率為25%。毒性反應:Ⅰ～Ⅱ度骨髓抑制7 例，Ⅳ度骨髓抑制2 例;Ⅰ度胃腸道反應2 例，輕度肝功能損害4 例，合并肺部感染1 例。

2.2 PTCL 患者化療前后外周血中初始T 細胞和記憶T 細胞的比較 PTCL 患者化療前外周血中CD4+T 細胞明顯低于正常對照組，而CD8+T 細胞明顯升高，CD4+/CD8+明顯降低。治療后外周血中CD4+T 細胞仍低于正常對照組，但較治療前明顯升高，而治療后CD8+T 細胞則較治療前下降，CD4+/CD8+稍升高(圖1)。進一步分析CD45RA+和CD45RO+T 細胞在兩個亞群的比例情況，發(fā)現CD4+CD45RO+細胞治療前明顯降低，治療后稍升高，而CD4+CD45RA+細胞治療前明顯升高，治療后則下降，而CD8+CD45RO+細胞、CD8+CD45RA+治療前明顯升高，治療后稍降低(圖2)。

2.3 療效與患者外周血T 淋巴細胞亞群關系 將20 例PTCL 患者按療效分為化療有效組和無效組，兩組治療前后外周血CD4+表達無統計學差異，而治療前后有效組的初始T 細胞(CD4+CD45RA+)均明顯高于無效組，差異有統計學意義，記憶T 細胞(CD4+CD45RO+)差異無統計學意義(圖3)。

圖1 PTCL 組、治療后組與對照組外周血CD4 +和CD8 +T 細胞亞群比較(%)Fig.1 Comparison of CD4 + and CD8 + T cells subgroup in peripheral blood between PTCL group，after cure group and control group(%)

圖2 PTCL 組、治療后組與對照組外周血CD4 +和CD8 +T 細胞中CD45RA + 和CD45RO + T 細胞分布情況(%)Fig.2 CD45RA + and CD45RO + cells distribution of CD4 + and CD8 + T cells in peripheral blood between PTCL group，after cure group and control group(%)

圖3 化療有效組與無效組CD4 + CD45RA + 和CD4 +CD45RO +T 細胞的比較(%)Fig.3 CD45RA + and CD45RO + cells distribution of CD4 + T cells in chemotherapy response group and no response group(%)

3 討論

外周T 細胞淋巴瘤在中國等亞洲國家較多見，約占整個淋巴瘤發(fā)病的20%～30%［3，4］。其病因尚不清楚，研究發(fā)現與免疫缺陷、病毒感染、基因突變等有關。與B 細胞淋巴瘤相比，外周T 細胞淋巴瘤發(fā)病時多處于中晚期，侵襲性較強，常有皮膚、肝脾、骨髓的侵犯。CHOP 方案常用于外周T 細胞淋巴瘤的一線治療，但緩解期短，復發(fā)快，預后不良，遠期生存率低［5］。最近報道含蒽環(huán)類藥物的化療方案沒有提高總生存率［6］，而其他新的聯合化療方案，如CMED 方案、EPOCH 方案［7］，尚未得到廣泛的公認。而免疫靶向治療可能是未來臨床研究的方向，但研究的前提需了解機體的細胞免疫功能。

機體的抗腫瘤免疫以T 細胞介導的細胞免疫為主，細胞免疫功能缺陷，可能是腫瘤形成的原因之一。我們前期研究發(fā)現PTCL 患者外周血中CD4+CD45RA+T 細胞明顯增加，而CD4+CD45RO+T 細胞比例明顯降低，考慮PTCL 胸腺近期輸出功能仍較強。為了進一步了解化療后PTCL 患者體內初始T 細胞和記憶T 細胞的變化，我們對20 例PTCL 患者進行四周期CHOP 方案化療，結果顯示20 例PTCL 患者化療后15 例腫瘤獲得緩解，5 例出現腫瘤進展，化療有效率75%，說明CHOP 方案近期療效尚可。通過檢測T 細胞亞群，我們發(fā)現PTCL 患者治療前外周血中CD4+T 細胞明顯降低，CD8+T細胞明顯升高，CD4+/CD8+比例明顯降低，這提示PTCL 患者體內T 細胞亞群的平衡失調，細胞免疫功能低下，輔助性T 細胞的減少降低了機體對抗腫瘤的免疫效應，CD8+T 細胞可能受PTCL 相關抗原刺激增殖，從而使其比例發(fā)生變化。而CHOP 方案治療后CD4+T 細胞較治療前明顯升高，但仍低于正常對照組，提示化療雖抑制腫瘤的增殖，使患者輔助性T 細胞增殖增加，CD8+T 細胞增殖受減少，機體免疫應答的正調節(jié)點占優(yōu)勢，增強機體抗腫瘤免疫效應，但機體的免疫功能仍未能完全恢復至正常，說明即使是化療有效控制腫瘤，但機體仍存在免疫功能低下。

我們前期研究發(fā)現PTCL 患者外周血中CD4+CD45RA+T 細胞明顯增加，而CD4+CD45RO+T 細胞比例明顯降低，考慮PTCL 胸腺近期輸出功能仍較強。我們進一步分析CD45RA+和CD45RO+T 細胞的比例，同樣發(fā)現PTCL 患者外周血中CD4+CD45RA+和CD4+CD45RO+細胞的變化特點與我們前期研究結果相同，也與Yang［8］的研究結果相似。PTCL 患者治療前初始T 細胞升高，可能由于腫瘤抗原的刺激，機體產生一定的免疫應答的結果。而CD4+CD45RO+T 細胞相對降低考慮與其他亞群比例增加，尤其是CD8+T 細胞比例增加相關。進一步我們發(fā)現CHOP 治療后，CD4+CD45RA+和CD8+CD45RA+T 細胞，以及CD8+CD45RO+細胞比例降低，其原因可能有幾個方面，最主要的是可能是化療對T 細胞的直接抑制作用，因此，對于化療后，胸腺輸出功能的觀察更需要動態(tài)隨訪不同時間點CD4+CD45RA+和CD8+CD45RA+T 細胞的變化特點，有可能得出更全面的結論，其次，由于治療后腫瘤抗原的刺激減弱，也可能存在初始T 細胞向記憶T 細胞轉化增多，使初始T 細胞下降，記憶T 細胞升高。

通過分析療效與初始T 細胞的關系，我們發(fā)現PTCL 患者中化療有效組和化療無效組相比，治療前有效組的初始T 細胞較無效組明顯增高，化療后，有效組初始T 細胞雖較前下降但仍明顯高于化療無效患者，而記憶T 細胞(CD45RO+)的差異則無統計學意義。這一結果提示病人伴有較強胸腺輸出功能可能是對治療敏感的一個有利因素。我們前期研究發(fā)現，白血病病人T 細胞的活化和免疫應答功能明顯低于正常人，預后較好的AML 亞型伴有較高的胸腺輸出功能［9，10］，盡管我們從細胞表型上檢測到這些CR45RA +T 細胞變化，仍然有待進一步檢測其活化和效應功能，才能更全面地評價病人的T 細胞免疫功能狀態(tài)及治療后免疫功能的變化，同時，可以根據病人T 細胞免疫的這些優(yōu)勢特點，選擇性的上調T 細胞的功能，提高病人抗腫瘤的能力。

綜上所述，本研究首先分析了PTCL 病人化療前后外周血中T 細胞中CD4+和CD8+T 細胞中初始T'細胞和記憶T 細胞亞群的變化，發(fā)現治療前病人初始T 細胞含量較高，提示胸腺輸出功能仍較強，而治療后初始T 細胞含量明顯降低，化療前患者外周血初始T 細胞的水平可能與患者的近期化療效果間存在聯系，通過該細胞亞群的檢測，可能幫助我們更好的預測化療效果。另外，臨床上可以根據免疫功能狀態(tài)結合臨床資料，有針對性地制定治療方案，這對患者的生存率，改善患者的生存質量都有著積極的意義。

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