IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-17A 在肝癌組織中表達(dá)及其與乙肝病毒感染的關(guān)系①

黃傳鐘 李潔羽 陳淑萍 劉 枋 葉韻斌 (福建省腫瘤醫(yī)院腫瘤免疫學(xué)研究室，福建醫(yī)科大學(xué)教學(xué)醫(yī)院，福建省腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350014)

原發(fā)性肝癌(Primary liver cancer，PLC)是在亞洲尤其在中國(guó)發(fā)病率很高的惡性腫瘤，我國(guó)肝癌發(fā)病率和死亡率是世界上最高的，占全球每年新發(fā)病例和死亡人數(shù)的55%以上［1］。肝癌根據(jù)其病理類型可以分為肝細(xì)胞癌、膽管細(xì)胞癌和混合型癌，其中以肝細(xì)胞癌最為常見(jiàn)。近年來(lái)隨著腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展，免疫在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越受到重視，國(guó)家基金委于2008 年開(kāi)始設(shè)立的重大研究計(jì)劃“非可控性炎癥惡性轉(zhuǎn)化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其分子機(jī)制”中，很多項(xiàng)目的立項(xiàng)就是基于肝炎病毒引發(fā)的慢性肝炎及免疫反應(yīng)對(duì)肝癌的作用，各種免疫細(xì)胞及其因子與腫瘤的關(guān)系已成為腫瘤防治研究的熱點(diǎn)之一。

輔助性T 細(xì)胞(Th 細(xì)胞)在免疫反應(yīng)中起著重要的作用，按照其生物學(xué)功能的不同，一直以來(lái)將其分為兩大亞群:以分泌IFN-γ 為特征的Th1 細(xì)胞，以及以分泌IL-4 為特征的Th2 細(xì)胞;近年來(lái)又確定了另一種以分泌IL-17 為特征的Th17 細(xì)胞(其數(shù)量與IL-17 表達(dá)水平正相關(guān))，它的作用不再僅局限于自身免疫性疾病，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也有一定的作用［2，3］。本項(xiàng)目以肝細(xì)胞癌臨床手術(shù)患者為研究對(duì)象，采用流式細(xì)胞微球陣列術(shù)(CBA)分析法檢測(cè)39例原發(fā)性肝細(xì)胞癌的癌組織及非癌組織標(biāo)本中IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-17A 細(xì)胞因子的含量，分析探討細(xì)胞因子在肝癌免疫微環(huán)境中的意義，評(píng)價(jià)肝細(xì)胞肝癌患者局部免疫抑制的狀況，并與患者臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較分析，為探求肝癌的免疫治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 流式細(xì)胞儀(FACS Calibar美國(guó)BD 公司)，組織樣本制備儀(Medimachine 美國(guó)BD 公司);CBA 試劑盒為美國(guó)BD 公司產(chǎn)品，其中包括了IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-17A(Th17)。

1.2 臨床標(biāo)本 39 例2012 年1 月～12 月就診的肝細(xì)胞癌患者收集經(jīng)手術(shù)切除的新鮮肝癌組織及非癌肝組織標(biāo)本。所有病例術(shù)前均未接受過(guò)包括肝動(dòng)脈栓塞化療在內(nèi)的任何治療，術(shù)后病理證實(shí)為肝細(xì)胞性肝癌(見(jiàn)圖1)。按照UICC 分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期2例，Ⅱ期19 例，Ⅲ期15 例，Ⅳ期3 例;男31 例，女8例;年齡31～69 歲，中位年齡53 歲;乙肝病毒載量≥1 000 者17 例，＜1 000 者22 例。

1.3 標(biāo)本收集 將新鮮肝癌組織(距癌邊緣1 cm以內(nèi))及非癌組織(距癌邊緣3～5 cm 以上)清除周圍壞死組織及血塊等，分別稱取等量樣本，加1 ml PBS，用組織樣本制備儀處理成單細(xì)胞懸液，離心后收集上清，凍存于-80℃冰箱。

1.4 流式CBA 法檢測(cè) 取-80℃保存的肝癌、非癌組織上清，4℃融化后利用CBA 試劑盒標(biāo)記細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-17A)。然后制備混合微球:先計(jì)算樣品的管數(shù):樣品管數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)管+陰性對(duì)照管+實(shí)驗(yàn)管，實(shí)驗(yàn)所需用的總微球量=樣品管數(shù)×50 μl，再計(jì)算每一種標(biāo)記細(xì)胞因子的微球所需要的量，然后分別加到一個(gè)混合管(5 種細(xì)胞因子)充分混勻，每管各加混合微球液50 μl 和PE 試劑50 μl。1～9 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管從低濃度到高濃度加標(biāo)準(zhǔn)液體(5 種細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品稀釋按照試劑盒說(shuō)明書(shū)制備)。陰性對(duì)照管加入50 μl 稀釋液，實(shí)驗(yàn)樣品加入50 μl 充分混勻的組織上清，室溫避光反應(yīng)3 h，每管加1 ml 洗液，1 400 r/min 離心5 min，加300 μl 洗液混勻3～5 min 后上機(jī)采集。用BD CBA FCAP Array Software 軟件自動(dòng)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線和分析待檢品的結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 收集患者臨床資料，包括性別、年齡、病理類型、肝硬化、乙肝病毒感染情況、AFP 表達(dá)等數(shù)據(jù)，與流式CBA 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包SPSS 13.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。癌與非癌組織間及不同病理分期間的差異分析用Wilcoxon 符號(hào)秩和檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 收集經(jīng)手術(shù)切除的新鮮肝癌組織及非癌肝組織標(biāo)本，經(jīng)石蠟包埋、HE 染色證實(shí)為肝癌組織以及肝正常組織，見(jiàn)圖1。

2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)品終濃度分別為5 000、2 500、1 250、625、312.5、156、80、40、20、0 pg/ml，計(jì)算機(jī)處理并繪制曲線，曲線擬合適配度(R Square)均在95%以上，見(jiàn)圖2。

2.3 應(yīng)用CBA 法檢測(cè)39 例肝癌手術(shù)患者的肝癌組織和非癌組織中細(xì)胞因子的表達(dá) 在肝癌組織中IL-2、IL-4、IFN-γ 的表達(dá)均較非癌組織有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中IL-2 有顯著差異;而IL-6、IL-17A 的表達(dá)均較非癌組織有顯著差異。見(jiàn)表1。

2.4 不同臨床分類患者的Th17 表達(dá)比較 無(wú)論是肝癌組織還是非癌組織，Th17 的表達(dá)與性別、年齡、分期、病理、肝硬化、AFP 水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而是與乙肝病毒載量密切相關(guān)，高病毒載量的患者其Th17 的表達(dá)顯著高于低病毒載量的患者，見(jiàn)表2。

圖1 肝癌與非癌組織HE 染色結(jié)果(×200)Fig.1 HE staining of liver cancer tissue and non-cancer tissue(×200)

圖2 5 種細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curves of 5 kinds of cytokines

表1 CBA 法檢測(cè)肝癌患者肝癌組織與非癌組織中細(xì)胞因子水平(pg/ml，±s)Tab.1 Expression of cytokines in liver cancer tissue and non-cancer tissue by CBA(pg/ml，±s)

表1 CBA 法檢測(cè)肝癌患者肝癌組織與非癌組織中細(xì)胞因子水平(pg/ml，±s)Tab.1 Expression of cytokines in liver cancer tissue and non-cancer tissue by CBA(pg/ml，±s)

Note:1)Statistical difference;2)Significant difference.

表2 Th17 與肝癌患者臨床資料比較分析(pg/ml，±s)Tab.2 Comparative analysis of Th17 and clinical data of patients with liver cancer(pg/ml，±s)

表2 Th17 與肝癌患者臨床資料比較分析(pg/ml，±s)Tab.2 Comparative analysis of Th17 and clinical data of patients with liver cancer(pg/ml，±s)

Note:1)P ＜0.05，Statistical difference.

3 討論

Th17 細(xì)胞是在研究實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)等自身免疫性疾病的過(guò)程中確定的一類新的Th 細(xì)胞亞群［4］，這類細(xì)胞以分泌IL-17 為特征，具有很強(qiáng)的促炎癥作用，參與機(jī)體內(nèi)多種自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展。近年來(lái)對(duì)于Th17 細(xì)胞的研究已經(jīng)不再局限于自身免疫性疾病，發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也有一定的作用［5］。發(fā)生腫瘤時(shí)，患者外周血中Th17細(xì)胞水平增高，這一點(diǎn)可以在肝癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、纖維肉瘤等惡性腫瘤中得到印證［6-8］;此外，在腫瘤組織的浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)、骨髓、脾臟中存在比較多的Th17細(xì)胞，而在腫瘤引流淋巴結(jié)(TDLN)中含量相對(duì)較少。

在一些研究中發(fā)現(xiàn)，Th17 細(xì)胞水平的增高預(yù)示著腫瘤患者的預(yù)后較差:進(jìn)展期胃癌患者外周血中的Th17 細(xì)胞數(shù)量明顯多于正常人和早期患者，且該水平與患者的pTNM 分期正相關(guān)［9］;肝癌中，瘤內(nèi)Th17 細(xì)胞的增加，伴隨的是患者總體生存率和無(wú)病生存率的下降［10］。但是在其他一些研究中，Th17細(xì)胞水平的增高反映了腫瘤的預(yù)后較好:前列腺癌腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞(TIL)中Th17 細(xì)胞的水平，與前列腺癌的Gleason 分級(jí)負(fù)相關(guān)［11］;小細(xì)胞肺癌(SCLC)是一類具有播散傾向的惡性腫瘤，限制期(LD-SCLC)患者和初發(fā)患者的Th17 細(xì)胞水平，較進(jìn)展期(EDSCLC)和復(fù)發(fā)患者高，且長(zhǎng)期生存的SCLC 患者中，Th17 的量要高于Treg［12］;還有研究表明早期胃癌TIL 中Th17 細(xì)胞水平較進(jìn)展期胃癌的要高。同時(shí)，Th17 細(xì)胞在肝癌中所發(fā)揮的作用受到多種細(xì)胞因子共同影響。IL-2 可以通過(guò)上調(diào)STAT5，下調(diào)STAT3，抑制RORγt 的表達(dá)，增強(qiáng)Foxp3 的表達(dá)，從而抑制IL-17 的表達(dá)及Th17 細(xì)胞的產(chǎn)生［13］;但是最近又有研究表明，在人卵巢癌中IL-2 可以誘導(dǎo)卵巢癌中的Treg 細(xì)胞向Th17 轉(zhuǎn)化［14］。因此，對(duì)于IFNγ、IL-2 等在Th17 細(xì)胞分化中的具體作用，還需要進(jìn)一步的探究。

那到底Th17 在肝癌中的表達(dá)是上述的哪種情況，又為什么會(huì)出現(xiàn)這種矛盾的結(jié)果?本項(xiàng)目收集39 例原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的癌與非癌組織，應(yīng)用流式細(xì)胞微球陣列術(shù)(CBA)檢測(cè)IL-2、IL-4、IL-6、IFNγ、IL-17A 細(xì)胞因子水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Th17 細(xì)胞所分泌的IL-17A，以及IL-6 在肝癌組織中的表達(dá)與非癌組織比較有顯著性升高，而IL-2、IL-4、IFN-γ 則在非癌組織中高表達(dá)。因此在肝癌中，Th17 細(xì)胞的分化過(guò)程中，IL-6 可能起促進(jìn)作用，而IL-2、IL-4、IFN-γ則可能起抑制作用。同時(shí)通過(guò)與患者臨床相關(guān)資料相比較，發(fā)現(xiàn)Th17 的表達(dá)與患者的乙肝病毒載量密切相關(guān)，高病毒載量的患者其Th17 的表達(dá)顯著高于低病毒載量的患者，而與患者的分化程度、分期、肝硬化等指標(biāo)無(wú)關(guān)。國(guó)外的研究亦表明，幽門螺旋桿菌(Hp)、丙型肝炎病毒(HCV)的感染也會(huì)導(dǎo)致Th17 細(xì)胞水平增高，因此這些感染性因素包括HBV的感染影響了Th17 細(xì)胞與腫瘤相關(guān)性研究的結(jié)果［15，16］，在以后的研究中需要予以重視。而病毒感染為什么會(huì)引起Th17 的普遍升高則需要我們繼續(xù)深入的探討和研究。

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