利用體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)篩選膀胱癌特異性結(jié)合肽①

羅俊茜 張 帆 楊曉峰 羅 芳 劉杰昊 龐建智 閆三華 張小雷

(山西醫(yī)科大學微生物學與免疫學教研室，太原 030001)

膀胱癌(Bladder carcinoma)是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其中75%～85%為淺表性膀胱腫瘤，又稱為非肌肉浸潤性腫瘤(Non muscle invasive bladder tumor，NMIBC)。雖然采取膀胱癌手術(shù)及術(shù)后綜合療法顯著提高了患者5 年生存率，但因膀胱癌早期血尿?？勺孕袦p輕或停止，易給患者造成“好轉(zhuǎn)”或“治愈”的錯覺而貽誤治療［1-3］。因此，針對膀胱原位癌診斷困難、術(shù)中腫瘤不易識別和術(shù)后需膀胱鏡復查的臨床問題，積極尋找特異性強、陽性率高、能識別微小腫瘤的腫瘤標志物將是改變膀胱癌診療現(xiàn)狀的有效手段之一。

噬菌體展示技術(shù)于1985 年由Smith 等［4］首次創(chuàng)造性地提出，現(xiàn)已成為發(fā)現(xiàn)新功能多肽和改變已有多肽性質(zhì)的有效工具，廣泛應用于蛋白質(zhì)工程和細胞生物學。其原理為通過將一定的外源蛋白質(zhì)或多肽的基因表達產(chǎn)物融合到噬菌體衣殼蛋白PⅢ或PⅧ端，并在噬菌體顆粒表面展示該基因編碼的蛋白，同時將遺傳密碼信息整合到個體噬菌體的基因組中，從而在基因與蛋白質(zhì)或多肽間建立直接聯(lián)系［5］。1996 年，Pasqualini 等［6］在噬菌體展示技術(shù)體外篩選的基礎(chǔ)上，發(fā)展了體內(nèi)篩選方法。噬菌體展示技術(shù)體內(nèi)篩選方法將噬菌體展示技術(shù)施以體內(nèi)選擇壓力，進行腫瘤組織或其內(nèi)部血管特異性配體的篩選，從而能夠獲得具有靶向作用的噬菌體表面展示的小分子多肽序列。因此，為實現(xiàn)膀胱癌微小腫瘤的分子診斷和靶向治療，本研究以人膀胱癌細胞BIU87 為研究對象，采用體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)篩選人膀胱癌的特異性靶向多肽標志物，為膀胱癌早期診斷和靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 噬菌體展示環(huán)七肽庫試劑盒(Ph.D.-C7CTMPeptide Library Kit)購自NEW ENGLAND BioLabs，包括噬菌體展示環(huán)七肽庫(～1 ×1013pfu/ml);宿主菌E.coli ER2738;-96 gⅢ測序引物5'-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3'。SPF級BALB/c 雄性裸鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，3～4 周齡，體重15～18 g。人膀胱移行細胞癌細胞系BIU87 購自北京醫(yī)科大學泌尿外科研究所。人膀胱正常移行上皮細胞iMBT 購自武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司。M13 噬菌體單鏈基因組DNA 快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司。HRP/Anti-M13 單克隆抗體購自GE Healthcare。Matrigel 基質(zhì)膠購自BD 公司。兔抗M13 噬菌體抗體、羊抗兔-HRP 標記二抗購自Sigma。IPTG、Xgal、PEG-8000 等其余試劑購自北京索萊寶科技有限公司，并按照噬菌體展示環(huán)七肽庫試劑盒說明書配置。

1.2 實驗方法

1.2.1 荷瘤鼠模型制備 人膀胱移行細胞癌細胞BIU87 用含有10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)生長至95%后，用0.25%胰蛋白酶收獲細胞并4℃條件下懸浮于200 μl Matrigel 基質(zhì)膠中，將BIU87 細胞(1 ×107細胞/側(cè))注射于裸鼠雙側(cè)背部皮下，每天觀察并記錄腫塊直徑。

1.2.2 噬菌體展示肽庫體內(nèi)篩選 2%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉荷瘤裸鼠，尾靜脈注射噬菌體展示環(huán)七肽庫(約1 ×1010pfu)，體內(nèi)循環(huán)15 min 后，心臟灌注0.9%生理鹽水至裸鼠實質(zhì)性臟器發(fā)白，處死裸鼠，取腫瘤及對照組織，各取部分置于4%多聚甲醛固定，其余組織剪碎，TBS 洗滌3 次，0.1 mol/L Glycine(pH2.2)洗脫10 min，1 mol/L Tris-HCl(pH 9.0)中和，再用0.1%Trition X-100 作用2 h 以裂解細胞釋放內(nèi)化部分噬菌體，回收洗脫產(chǎn)物保存。取10 μl 測滴度，并另取10 μl 擴增，用于下一輪篩選。每輪篩選前后用LB/IPTG/Xgal 瓊脂平板測定噬菌體滴度。經(jīng)過3 輪體內(nèi)篩選后，隨機挑取30 個藍色單克隆噬菌體斑制備原種用于鑒定。

1.2.3 免疫組織化學鑒定噬菌體肽庫體內(nèi)分布 將上述各組織經(jīng)4%多聚甲醛固定過夜，常規(guī)石蠟包埋，切片(4 μm)，60℃恒溫烘烤后脫蠟至水，3%H2O2-甲醇(1∶9)于37℃孵育0.5 h，微波抗原修復，5%BSA 濕盒封閉0.5 h，滴加兔抗M13 噬菌體抗體(1∶200)于4℃過夜，次日滴加羊抗兔-HRP 標記二抗(1∶50)37℃孵育0.5 h，DAB 顯色后蘇木素復染，脫水、透明、中性樹膠封片，待切片干燥后用Scanscope 組織病理切片掃描儀掃描、分析。

1.2.4 ELISA 初步鑒定單克隆噬菌體 將人膀胱移行細胞癌細胞系BIU87 及人膀胱正常移行上皮細胞iMBT 以密度1 ×104個/孔間隔接種于96 孔板，待細胞貼壁、長滿單層后無血清RPMI1640 處理1 h，4%多聚甲醛固定后滴加3%過氧化氫于37℃培養(yǎng)箱孵育0.5 h，5%PBS-BSA 封閉1 h 后，加入1×1010pfu/孔單克隆噬菌體4℃條件過夜，每個單克隆噬菌體孵育BIU87 及iMBT 各3 孔，次日加入HRP/Anti-M13 單克隆液(1 ∶5 000)，TMB 顯色及HCl 終止，酶標分析儀檢測450 nm 處OD 值。以體外第一輪洗脫得到的未結(jié)合噬菌體為陰性對照，PBS 為空白對照。計算公式為:親和力=［BIU87(OD450nm 克隆-OD450nm 陰性對照克隆)］/［iMBT(OD450nm 克隆-OD450nm 陰性對照克隆)］，親和力≥2 為陽性克隆。

1.2.5 測序及序列分析 參照《分子克隆》第3 版及M13 噬菌體單鏈基因組DNA 快速提取試劑盒說明書，提取單克隆噬菌體單鏈DNA，送華大基因(BGI)測序。根據(jù)測序結(jié)果推導出多肽氨基酸序列，并使用NCBI/BLAST、SwissProt 進行分析。

1.2.6 多肽的合成 根據(jù)ELISA 鑒定及測序分析結(jié)果，選擇克隆重復率高表達的多肽序列NYZL1，由杭州中肽生化有限公司合成FITC 標記多肽(FITC-C6-NYZL1)。

1.2.7 激光掃描共聚焦顯微鏡術(shù)鑒定FITC 標記多肽 BIU87 細胞以1 ×105個/孔接種于培養(yǎng)皿，待細胞貼壁生長至40%左右，4%多聚甲醛固定細胞后加FITC-C6-NYZL1 共同孵育過夜，次日加DAPI復染，封片后共聚焦顯微鏡下觀察采集圖片。

1.2.8 流式細胞術(shù)鑒定FITC 標記多肽 BIU87 細胞以1 ×106個/ml 懸浮于離心管，避光條件下加FITC-C6-NYZL1 孵育3 h，PBS 作為空白對照，流式細胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 異體移植BIU87 細胞荷瘤裸鼠模型的建立 致瘤1 周后即可長出肉眼可見的腫瘤，逐日觀察記錄腫塊直徑，待直徑達2 cm 左右觸之質(zhì)硬，活動度較好，無化膿破潰即用于篩選，出瘤率達100%(圖略)。腫瘤組織HE 染色鏡下可見細胞彌散狀分布，大小較均一，細胞核大深染，呈圓形，核仁明顯并可見核分裂象，胞漿豐富(圖1)。

2.2 噬菌體展示環(huán)七肽庫體內(nèi)富集 將Ph.D.C7C 肽庫尾靜脈注射入荷瘤裸鼠，經(jīng)過3 輪體內(nèi)親和篩選并洗脫后進行噬菌體滴度測定，結(jié)果顯示，隨著每一輪篩選，噬菌體回收率不斷提高，到第3輪篩選結(jié)束時，噬菌體從腫瘤組織的回收率是第1 輪的4.334 ×102倍，富集效果明顯(表1)。

圖1 荷瘤裸鼠腫瘤組織HE 染色(×200)Fig.1 HE staining of nude mice tumor tissue(×200)

2.3 噬菌體肽庫在腫瘤組織的富集 每一輪體內(nèi)篩選過程中，取腫瘤及對照組織進行免疫組織化學染色，每張切片(×200)隨機選取上、下、左、右、中視野觀察，利用Image Pro Plus 圖像分析系統(tǒng)分析噬菌體多肽與腫瘤及對照組織的結(jié)合情況，結(jié)果如圖2 顯示，腫瘤組織中富集的噬菌體肽庫隨著每一輪體內(nèi)篩選進行而增加，同時肝臟與腎臟組織因血管豐富、代謝速度快，均可非特異大量吸附文庫噬菌體，而肺與肌肉組織只有少量噬菌體肽庫結(jié)合。

2.4 膀胱癌細胞與陽性噬菌體克隆的富集 經(jīng)過3輪體內(nèi)篩選后，隨機挑取30個藍色單克隆噬菌體斑，利用ELISA 初步鑒定單克隆噬菌體對BIU87 親和力，檢測每孔OD450nm 并計算，結(jié)果顯示親和力≥2 的陽性單克隆噬菌體共有24 個，其中R2、R6、R8、R11、R12、R13、R14、R15、R17、R30 單克隆噬菌體親和力≥6，對BIU87 親和力強，為強陽性克隆(圖3)。

表1 噬菌體展示環(huán)七肽庫體內(nèi)篩選噬菌體克隆富集Tab.1 Enrichment rate of phage screening in vivo

圖2 免疫組化鑒定噬菌體肽庫體內(nèi)分布Fig.2 Immunohistochemical identified distribution of phage peptide libraries in vivo

圖3 單克隆噬菌體親和力Fig.3 ELISA identified phage clones affinity

圖4 激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-C6-NYZL1 對BIU87結(jié)合特異性Fig.4 Confocal laser scanning microscope identified specificity of FITC-C6-NYZL1

2.5 膀胱癌細胞特異結(jié)合噬菌體的測序 將ELISA 初步鑒定后親和力高的10 個噬菌體藍斑進行擴增并提取DNA 測序，獲得多肽序列，其中重復率最高的多肽序列為噬菌體R2、R6、R8、R11、R13、R14、R15、R30 序列CSSPIGRHC(8/10)，其次為R12序列CTMSNLKGC(1/10)、R17 序列CNNVLSQMC(1/10)。序列CSSPIGRHC 命名為NYZL1，運用NCBI/BLAST、SwissProt 等數(shù)據(jù)庫分析，NYZL1 與已知基因和蛋白無同源性，且國內(nèi)外文獻均未見報道。

2.6 化學合成FITC 標記多肽 多肽NYZL1 通過二硫鍵連接半胱氨酸耦合成環(huán)，由杭州中肽生化有限公司合成FITC-C6-NYZL1，通過HPLC 及MS 純化、鑒定該合成肽純度≥98%。

2.7 熒光顯微鏡鑒定FITC 標記多肽的特異性 為進一步鑒定FITC 標記多肽NYZL1 與人膀胱移行細胞癌細胞BIU87 具有親和力和特異性，將FITC-C6-NYZL1 與BIU87 孵育，PBS 作空白對照，鏡下觀察其結(jié)合情況，結(jié)果表明FITC-C6-NYZL1 在BIU87 細胞上有高富集熒光亮點，且均勻結(jié)合于細胞質(zhì)與細胞核中(圖4)。

表2 FITC-C6-NYZL1 與BIU87 結(jié)合的平均熒光強度值(±s)Tab.2 Mean fluorescence intensity value of FITC-C6-NYZL1 binding BIU87(±s)

表2 FITC-C6-NYZL1 與BIU87 結(jié)合的平均熒光強度值(±s)Tab.2 Mean fluorescence intensity value of FITC-C6-NYZL1 binding BIU87(±s)

Note:1)Statistically significant difference(P ＜0.01).Independent samples T-test.

2.8 流式細胞術(shù)鑒定FITC 標記多肽的特異性 將FITC-C6-NYZL1 與BIU87 細胞孵育后流式細胞儀觀察，結(jié)果顯示FITC-C6-NYZL1 與BIU87 結(jié)合的熒光強度值為53.1925，PBS 空白對照熒光強度值為6.67，P ＜0.01，差異有統(tǒng)計學意義(表2)。

3 討論

噬菌體展示作為一項選擇技術(shù)，將大量的外源性隨機多肽或蛋白與噬菌體病毒顆粒的DNA 編碼序列間建立了直接聯(lián)系，通過對隨機多肽文庫的篩選，分離出對靶細胞具有親和力或特異性改變的變異株。目前，應用噬菌體展示技術(shù)體內(nèi)篩選已得到針對不同腫瘤組織或血管的特異性靶向多肽配體，這些靶向多肽配體可顯示腫瘤組織或血管，或利用特異靶向多肽配體阻斷生長因子與受體結(jié)合，或攜帶細胞毒性藥物攻擊腫瘤組織，從而用于腫瘤診斷和治療［7-9］。Lee 等［10］通過T7 噬菌體展示肽庫篩選出人膀胱癌HT-1367 細胞系特異性導向肽CSNRDARRC，并證實該肽對膀胱癌患者的尿液及病理組織有一定的結(jié)合特異性。趙揚等［11-13］證明FITC 標記肽CSNRDARRC 可與膀胱癌T24 細胞系及人膀胱癌患者病理組織相結(jié)合，但結(jié)合特異性有待提高。本實驗利用噬菌體展示技術(shù)，以我國第一株自建人膀胱癌細胞BIU87［14］為靶細胞，旨在快速、高效的篩選出與人膀胱癌BIU87 細胞特異性結(jié)合的噬菌體克隆，從而獲得能與人膀胱癌靶向結(jié)合的氨基酸序列。相比體外培養(yǎng)的細胞，裸鼠移植瘤模型有著不可比擬的優(yōu)勢，目前已廣泛應用于模擬人體內(nèi)腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移機制等研究［15］。本實驗采用荷瘤動物模型進行完全體內(nèi)篩選，最大限度的模擬膀胱癌組織中的實際內(nèi)環(huán)境，借助自身組織、器官為對照，豐富了篩選靶蛋白的范圍，同時采用活體心臟灌注生理鹽水盡可能地減少體內(nèi)非特異性噬菌體的殘留，提高篩選的特異性。

本實驗通過三輪體內(nèi)篩選得到了一組對膀胱腫瘤特異性靶向能力的噬菌體克隆，通過免疫組織化學染色、ELISA 及DNA 測序分析初步鑒定噬菌體R2、R6、R8、R11、R13、R14、R15、R30 與人膀胱移行細胞癌細胞系BIU87 有較強親和力和特異性。對以上噬菌體克隆外源多肽進行生物信息學分析，序列由Ser、Pro、Ile、Gly、Arg、His 六種氨基酸組成，兩端以Cys 通過二硫鍵連接成為構(gòu)象穩(wěn)定的小分子多肽，該序列與NCBI/BLAST、SwissProt 等數(shù)據(jù)庫中已知基因和蛋白無同源性，且國內(nèi)外文獻均未見報道。本實驗通過激光掃描共聚焦顯微鏡術(shù)、流式細胞術(shù)進一步證實多肽NYZL1 對膀胱癌細胞的特異性，顯示人膀胱移行細胞癌細胞系BIU87 表面有多肽NYZL1 的特異性結(jié)合位點。多肽NYZL1 可能成為膀胱癌相關(guān)抗原的新配體，為膀胱癌早期診斷和靶向治療提供一定的理論依據(jù)。

目前，我們只在體外通過細胞和組織水平驗證了多肽NYZL1 對BIU87 的特異性，尚需繼續(xù)在整體動物水平上通過FITC-C6-NYZL1 活體示蹤驗證其特異性，以證實多肽NYZL1 是否在體內(nèi)具有腫瘤靶向性。

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