腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞對舌鱗癌細(xì)胞功能的影響及機制研究①

李 霞 李晉蕓 (佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院口腔系·附屬佛山市口腔醫(yī)院，佛山 528000)

口腔癌(Oral carcinoma)是頭頸部常見的惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的3%，也是世界上排名第六的最常見的惡性腫瘤［1］。研究表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程是腫瘤細(xì)胞與其相鄰多種基質(zhì)細(xì)胞相互作用的過程，基質(zhì)細(xì)胞包括纖維母細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和多種骨髓來源的祖細(xì)胞等。其中腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(Cancer associated fibroblasts，CAFs)能促進(jìn)包括結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，在腫瘤的形成過程中起著至關(guān)重要的作用［2］。但是CAFs 與口腔癌關(guān)系的研究較少。本項目探討了CAFs 對口腔癌細(xì)胞SCC-9 和CAL-27 增殖、遷移、侵襲的影響，并通過細(xì)胞因子抗體芯片檢測了細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子水平的變化，旨在進(jìn)一步明確CAFs 對口腔腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響和機制。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，0.25%胰蛋白酶(Gibco 公司，美國)，Matrigel(BD Lifesciences，美 國)，Transwell 小 室(Costar 公司，美國)。細(xì)胞因子抗體芯片試劑盒(Raybiotech，Norcross，GA，美國)。

1.2 實驗細(xì)胞株 口腔CAFs 的分離及鑒定參照文獻(xiàn)［3］。舌癌細(xì)胞株SCC-9 和CAL-27 由許青博士饋贈。

1.3 CAFs 對舌癌細(xì)胞株增殖能力的影響 用過表達(dá)紅色熒光蛋白(RFP)的慢病毒標(biāo)記口腔癌細(xì)胞(SSC-9 和CAL-27)，然后將5 ×104個表達(dá)RFP 的口腔癌細(xì)胞株SCC-9 或CAL-27 與CAFs 按1∶1比例混合后共同培養(yǎng)，細(xì)胞種植當(dāng)天記為1 d，在第1、3、5 天收集細(xì)胞，用酶標(biāo)儀檢測紅色熒光信號。SCC-9或CAL-27 單獨培養(yǎng)作為對照組，每組設(shè)3 復(fù)孔。計算相對增殖率(收集到的腫瘤細(xì)胞數(shù)/接種腫瘤細(xì)胞數(shù))。

1.4 CAFs 對舌癌細(xì)胞株遷移能力的影響 將處于對數(shù)生長期的舌癌細(xì)胞株SCC-9 或CAL-27 懸于無血清培養(yǎng)基，以每孔5 ×104個細(xì)胞等量接種于Transwell 上室。下室加入600 μl 細(xì)胞濃度為5 ×104個/ml 的CAFs 或600 μl 含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，每組3 復(fù)孔。培養(yǎng)24 h 后取出小室，用棉簽擦去上室內(nèi)細(xì)胞，濾膜下層的細(xì)胞倒置風(fēng)干后，0.1%結(jié)晶紫染色，每個孔隨機選取3 個視野計數(shù)，取平均值作為每個視野的細(xì)胞數(shù)，相對遷移率=實驗組遷移細(xì)胞數(shù)/對照組遷移細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 CAFs 對舌癌細(xì)胞株侵襲能力的影響 用Matrigel 稀釋液(1 ∶3)包被Transwell 上室底部濾膜。將Matrigel 于4℃過夜凍融后，在冰上用預(yù)冷的DMEM 稀釋Matrigel，加入transwell 上室中，每孔200 μl。將小室放于37℃恒溫箱30 min，用DMEM培養(yǎng)基輕輕清洗凝膠。按1.4 方法檢測侵襲到濾膜下層的細(xì)胞并計數(shù)，相對侵襲率=實驗組侵襲細(xì)胞數(shù)/對照組侵襲細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 CAFs 與SCC-9 共同培養(yǎng)對細(xì)胞因子表達(dá)的影響 將處于對數(shù)生長期的舌癌細(xì)胞株SCC-9 懸于無血清培養(yǎng)基，以每孔1 ×106個細(xì)胞等量接種于Transwell 上室，下室加入含等量CAFs 的無血清DMEM 600 μl。下室加入600 μl 不含細(xì)胞的無血清DMEM 培養(yǎng)基作為對照1。上室不含細(xì)胞，下室加含1 ×106個CAFs 的無血清DMEM 600 μl 為對照組2 。每組3 復(fù)孔。培養(yǎng)48 h 后取上清，3 500 r/min 離心20 min，-20℃保存。嚴(yán)格按說明書操作方法用細(xì)胞因子抗體芯片檢測細(xì)胞因子水平。用Image J software 分析，用所得到的細(xì)胞因子密度值/內(nèi)參密度值，得到相對細(xì)胞因子表達(dá)水平。

1.7 CAFs 對舌癌成瘤能力的影響 本動物實驗通過佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物實驗倫理審查。裸鼠品系BALB/c A-nu(nu/nu)，采用SPF 級飼養(yǎng)。將5 ×106個SCC-9 細(xì)胞與5 ×106個CAFs 混合后共同注入免疫缺陷鼠的后腿部皮下，體積0.1 ml(n=8)，相同體積的5 ×106個SCC-9 細(xì)胞單獨注入作為對照。6周后統(tǒng)一處死裸鼠，取出皮下腫瘤，照相、稱重并記錄腫瘤重量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS16.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，選用成組設(shè)計的單因素方差分析。顯著性水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CAFs 能刺激口腔腫瘤細(xì)胞增殖 研究發(fā)現(xiàn)到第五天口腔腫瘤細(xì)胞(Oral cancer cells，OCCs)與CAFs 共同培養(yǎng)組中OCCs 的數(shù)量明顯高于OCCs 單獨培養(yǎng)。提示CAFs 能促進(jìn)OCCs 增殖，見圖1、2。

圖1 CAFs 促進(jìn)SCC-9 細(xì)胞增殖Fig.1 CAFs stimulate proliferation of SCC-9

2.2 CAFs 能促進(jìn)口腔腫瘤細(xì)胞遷移 與對照組相比，CAFs 組有更多口腔腫瘤細(xì)胞遷移到下室。遷移到底面的腫瘤細(xì)胞SSC-9 +CAFs組與SCC-9單獨培養(yǎng)組相比比值為2.6±0.42;CAL-27+CAFs 組與CAL-27 單獨培養(yǎng)組相比比值為3.11±0.46。共同培養(yǎng)組OCCs 遷移能力明顯增強。見圖3、4。

圖2 CAFs 促進(jìn)CAL-27 細(xì)胞增殖Fig.2 CAFs stimulate proliferation of CAL-27

圖3 CAFs 促進(jìn)SCC-9 細(xì)胞遷移Fig.3 CAFs stimulate migration of SCC-9

圖4 CAFs 促進(jìn)CAL-27 細(xì)胞遷移Fig.4 CAFs stimulate migration of CAL-27

2.3 CAFs 能增強口腔腫瘤細(xì)胞侵襲能力 研究結(jié)果顯示，穿透matrigel 遷移到底面的腫瘤細(xì)胞SSC-9 +CAFs 組與SCC-9 單獨培養(yǎng)組相比比值為1.78±0.24;CAL-27 +CAFs 組與CAL-27 單獨培養(yǎng)組相比比值為2.39±0.37。實驗顯示共同培養(yǎng)組OCCs 侵襲能力明顯增強，見圖5、6。

圖5 CAFs 促進(jìn)SCC-9 細(xì)胞侵襲Fig.5 CAFs stimulate invasion of SCC-9

圖6 CAFs 促進(jìn)CAL-27 細(xì)胞侵襲Fig.6 CAFs stimulate invasion of CAL-27

圖7 CAFs-SCC9 共培養(yǎng)體系中CCL2、CCL5、IL-8 水平明顯升高Fig.7 CCL2，CCL5，IL-8 was significantly upregulated in CAFs-SCC-9 co-cultures

圖8 CAFs 能促進(jìn)裸鼠腫瘤生長Fig.8 CAFs promoted tumor growth in immunodefi-cient mices

2.4 CAFs 與OCC 細(xì)胞共同培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子表達(dá)增高 細(xì)胞因子抗體芯片結(jié)果分析顯示共同培養(yǎng)組細(xì)胞培養(yǎng)上清中CCL2、CCL5、IL-8 水平明顯升高。其中SCC9 并不表達(dá)CCL2 和CCL5。CAFs 單獨培養(yǎng)時不表達(dá)CCL5。由于共同培養(yǎng)體系中細(xì)胞總數(shù)量是對照組1 和對照組2 細(xì)胞數(shù)量之和，將共同培養(yǎng)組細(xì)胞因子水平與對照組1 和對照組2 細(xì)胞因子水平之和進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)CAFs 與SCC9 共同培養(yǎng)組中CCL2、CCL5、IL-8 水平明顯高于CAFs 單獨培養(yǎng)和SCC9 單獨培養(yǎng)中相應(yīng)因子水平之和，見圖7。

2.5 CAFs 能促進(jìn)口腔腫瘤生長 將SCC-9 細(xì)胞單獨或與CAFs 混合共同注入免疫缺陷鼠的皮下，6 周后取出移植腫物，照相、稱重并記錄腫瘤重量。SCC-9 組體積為(308±79)mm3，SCC-9 +CAFs 組體積為(512±61)mm3，SCCs 與CAFs 混合注入組移植腫物明顯大于SCC-9 單獨注入組，見圖8。

3 討論

近年來，世界范圍內(nèi)口腔癌的發(fā)病率呈上升趨勢。雖然近十幾年來隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和腫瘤藥物的不斷開發(fā)，腫瘤治療手段日益豐富，但是口腔癌的患者的臨床治療效果依然不理想，腫瘤患者的5 年生存率并無顯著提升［3，4］。深入地了解口腔腫瘤發(fā)生發(fā)展的機理將有利于口腔癌的治療。

近幾十年來，間質(zhì)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的腫瘤微環(huán)境在腫瘤形成發(fā)展過程中的作用受到密切關(guān)注。腫瘤細(xì)胞的間質(zhì)微環(huán)境被稱為"反應(yīng)性間質(zhì)"。其顯著特征為:細(xì)胞外基質(zhì)成分改變;出現(xiàn)活化的成纖維細(xì)胞［2］。這些活化的成纖維細(xì)胞被稱為肌成纖維細(xì)胞，即CAFs。CAFs 對腫瘤細(xì)胞有顯著的刺激作用。本研究發(fā)現(xiàn)，CAFs 能促進(jìn)口腔癌細(xì)胞系SCC-9 和CAL-27 增殖、遷移、侵襲，我們的研究與林靖雯等的研究結(jié)果相似［5］;裸鼠成瘤實驗表明CAFs能促進(jìn)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的體積增長。但是CAFs 與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用機制目前還不清楚。多種研究表明CAFs 通過分泌多種細(xì)胞因子來促進(jìn)腫瘤的生長和發(fā)展。例如，CAFs 通過分泌基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1)來富集內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌腫瘤生長［6］。CAFs也是基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metallopeptidase，MMPs)的主要分泌源，CAFs 通過分泌MMPs(例如MMP-2 等)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchyme transition，EMT)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移［7］。

為了進(jìn)一步明確CAFs 促進(jìn)口腔癌細(xì)胞系SCC-9 和CAL-27 增殖、遷移、侵襲的機制，本研究還采用細(xì)胞因子抗體芯片檢測了培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子水平的變化，結(jié)果提示在共培養(yǎng)體系中CCL2、CCL5、IL8水平明顯上升。CCL［Chemokine(C-C motif)ligand］屬于CC 趨化因子家族，CCL 對單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞，未成熟的B 細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞有細(xì)胞趨化作用。據(jù)文獻(xiàn)報道，CCL2 與口腔癌和唇癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與無癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)相比，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中CCL2+細(xì)胞百分率更高［8］;我們以前的研究也發(fā)現(xiàn)CAFs 細(xì)胞通過分泌CCL2 對口腔癌細(xì)胞生長和腫瘤形成起著促進(jìn)作用［9］。乳腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中表達(dá)有CCL5，而正常的淋巴結(jié)及癌細(xì)胞中均無CCL5 的表達(dá)。CCL5 可能通過PI3K-Akt信號途徑、影響MMP-2 的產(chǎn)生，促進(jìn)肝癌細(xì)胞Huh7 的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲［10］。

IL-8 與腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究較多，研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中IL-8 及其受體CXCR1 和CXCR2 表達(dá)明顯升高;IL-8 能通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生、抑制其凋亡、增強血管的通透性、增強膠原酶的活性等促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。IL-8 單克隆抗體能明顯抑制裸鼠原位膀胱癌的生長［11］。腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子水平的改變是口腔腫瘤細(xì)胞行為變化的重要因素，但是這些細(xì)胞因子變化的分子機制目前并不清楚，進(jìn)一步明確CAFs 促進(jìn)腫瘤生長的分子機制將有利于探討有效的口腔腫瘤治療方法。

本實驗探討了CAFs 對口腔癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響，并通過檢測細(xì)胞因子水平初步分析了產(chǎn)生影響的可能原因，對明確口腔腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制有積極意義。進(jìn)一步引入正常成纖維細(xì)胞，比較正常成纖維細(xì)胞和CAFs 對口腔癌細(xì)胞的影響，能夠更好地反映不同腫瘤微環(huán)境的差異;更深入探討細(xì)胞因子水平改變的分子機理，這將是我們下一步研究的方向。

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