運動對大鼠脾臟T 淋巴細胞增殖及T 細胞亞群的影響研究

聶 健 王冀邯 (吉林工商學院，長春 130062)

運動與機體免疫功能的關系近年來逐漸受到大家重視，普遍認可的是適當運動鍛煉有助于提高機體免疫力［1，2］，而產(chǎn)生這種改變的詳細機制尚不明確。脾臟作為機體最重要的外周淋巴器官，是成熟淋巴細胞的定居部位。脾臟中成熟T 淋巴細胞行使著機體“細胞免疫”角色，其中T 細胞增殖是機體對抗原刺激產(chǎn)生免疫應答的重要過程，能夠體現(xiàn)機體的細胞免疫效應。T 淋巴細胞包含CD4+和CD8+亞群，各亞群的含量及CD4/CD8 比例是衡量機體免疫系統(tǒng)穩(wěn)定的關鍵因素［3］。因此，本研究旨在探討運動鍛煉對機體脾臟T 淋巴細胞增殖能力及T 細胞亞群的影響，分析運動影響體免疫功能的部分可能性機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選擇健康雄性SD 大鼠24只(購自吉林大學白求恩醫(yī)學院動物實驗中心)，隨機分為三組:對照組、30 min 運動組、60 min 運動組。對照組平時不運動，運動組進行無負重游泳:30 min運動組第一周每天適應性游泳10 min，以后每天游泳30 min，共8 周;60 min 運動組第一周每天適應性游泳30 min，以后每天游泳60 min，共8 周。

1.2 實驗試劑及儀器 RPMI1640 培養(yǎng)液(Hyclone，USA)，F(xiàn)CS 胎牛血清(Gibco，USA)，刀豆蛋白A(ConA，Sigma，USA)，臺盼藍染液(北京鼎國生物技術有限責任公司)，MTT 及DMSO(Trevigen，USA)，CD3e-PE-Cy5、CD4-FITC、CD8a-PE 抗大鼠抗體(BD Biosciences，USA)。超凈工作臺(蘇州安泰技術有限公司)，低溫離心機(上海安亭科學儀器廠)，CO2細胞培養(yǎng)箱(SANYO，JAPAN)，酶標儀(Bioteck，USA)，流 式 細 胞 儀(BD Biosciences，USA)。

1.3 制備大鼠脾臟淋巴細胞懸液 末次運動后24 h 對大鼠進行腹腔麻醉，無菌條件下取出大鼠脾臟，放入含有RPMI1640 培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中研磨，經(jīng)200目不銹鋼濾網(wǎng)濾過細胞，1 000 r/min 離心5 min 收集脾細胞沉淀;加入適當紅細胞裂解液，吹打混勻，室溫作用5～10 min，1 000 r/min 離心5 min 收集細胞沉淀;經(jīng)PBS 洗滌細胞2 次，0.4%臺盼藍染液染色2～3 min，觀察活細胞數(shù)＞95%;加入RPMI1640完全培養(yǎng)液制備脾細胞懸液，調(diào)整細胞懸液終濃度為1 ×107細胞/ml。

1.4 脾臟T 淋巴細胞增殖能力檢測 選用刀豆素A(ConA)作為促有絲分裂素，MTT 法檢測大鼠脾臟T 淋巴細胞的增殖能力。具體步驟:將制備好的大鼠脾細胞懸液加入96 孔板培養(yǎng)，100 μl/孔，繼而加入經(jīng)RPMI1640 完全培養(yǎng)液配制的ConA 100 μl(終濃度5 μg/ml)，每只大鼠設3 復孔。置于5% CO2，37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)44 h，加入MTT 20 μl/孔(終濃度5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出培養(yǎng)板，3 000 r/min 離心10 min，小心吸去上清液，每孔加入150 μl DMSO溶解甲瓚，輕輕震蕩，用酶標儀測定波長570 nm 處OD 值。

1.5 脾臟T 淋巴細胞亞群檢測 取濃度為1 ×107細胞/ml 的脾細胞懸液200 μl，PBS 液1 000 r/min，5 min 洗滌細胞2 次，離心，500 μl PBS 懸浮吹打細胞。向各待測樣本中分別加入抗體CD3+，抗體CD4+，抗體CD8+，并設定對照組(不加任何抗體)及三個單克隆抗體組(分別只加入一種單克隆抗體)，依據(jù)抗體說明書調(diào)整抗體終濃度。避光常溫孵育30 min，繼續(xù)PBS 洗滌細胞兩次，離心，500 μl PBS 懸起細胞，上流式細胞儀檢測。

1.6 統(tǒng)計學方法 運用SPSS21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。各組實驗數(shù)據(jù)以平均值±s 表示，兩組間顯著性分析用兩樣本均數(shù)差別的t 檢驗，P ＜0.05 表示有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 運動對大鼠脾臟T 淋巴細胞增殖能力的影響 不同強度的運動可以改變大鼠脾臟T 淋巴細胞的增殖能力，結果如表1 所示:與對照組相比，30 min 運動組大鼠脾臟T 淋巴細胞增殖能力升高(P ＜0.05)，但60 min 運動組大鼠脾臟T 淋巴細胞增殖能力輕度降低，變化無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

2.2 運動對大鼠脾臟T 淋巴細胞亞群的影響 不同強度的運動可以改變大鼠脾臟T 淋巴細胞亞群組分，結果如圖1 及表2 所示:與對照組相比，30 min 運動組大鼠脾臟CD4+T 細胞百分數(shù)及CD4+/CD8+比例升高(P ＜0.05)，60 min 運動組大鼠脾臟CD4+T 細胞百分數(shù)及CD4+/CD8+比例輕度升高，與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P ＞0.05);各運動組CD8+T 細胞百分數(shù)與對照組相比改變無統(tǒng)計學差異(P ＞0.05)。

表1 MTT 法測定大鼠脾臟T 淋巴細胞增殖能力(±s)Tab.1 Examination of spleen T lymphocyte proliferation by MTT(±s)

表1 MTT 法測定大鼠脾臟T 淋巴細胞增殖能力(±s)Tab.1 Examination of spleen T lymphocyte proliferation by MTT(±s)

Note:Compared with the control group，1)P ＜0.05.

圖1 流式細胞術檢測各組大鼠脾臟T 淋巴細胞亞群Fig.1 Examination of CD4 +，CD8 +，CD4 +/CD8 + T lymphocytes in spleen of rats by FCM

表2 流式細胞儀檢測大鼠脾臟T 淋巴細胞亞群(±s)Tab.2 Levels of CD4 +，CD8 +，CD4 +/CD8 + T lymphocytes in spleen of rats

表2 流式細胞儀檢測大鼠脾臟T 淋巴細胞亞群(±s)Tab.2 Levels of CD4 +，CD8 +，CD4 +/CD8 + T lymphocytes in spleen of rats

Note:Compared with the control group，1)P ＜0.05.

3 討論

適當運動鍛煉有助于提高機體抵抗力及免疫功能，但并非任何強度的運動都會帶來有利的影響［1］。T 淋巴細胞的增殖能力及亞群變化在一定程度上反映了機體的細胞免疫功能，我們的研究顯示，30 min 運動組大鼠脾臟T 淋巴細胞的增殖能力及CD4+T 細胞亞群較對照組升高有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，一定程度上促進了機體的T 淋巴細胞免疫功能;但60 min 運動組大鼠脾臟T 淋巴細胞的增殖能力并未隨著運動量增加繼續(xù)提高，而較對照組產(chǎn)生了無統(tǒng)計學意義的下降趨勢，60 min 運動組大鼠脾臟CD4+T 細胞亞群及CD8+/CD4+亦無顯著改變(P ＞0.05)。

適當?shù)倪\動鍛煉可以增加免疫細胞的數(shù)量，抑制免疫細胞凋亡［4］，增強其增殖活性。這種效果在老年機體中表現(xiàn)尤為突出，研究表明適宜的運動明顯提高了老年人體內(nèi)CD4+T 細胞，改善了Th1/Th2平衡［5］。另外一項研究對乳腺癌患者進行了6 個月的適當鍛煉，檢測其淋巴細胞增殖活化能力提高［6］。相似研究顯示有氧運動有助于增強脾臟介導的免疫功能，表現(xiàn)為CD4+細胞數(shù)量及CD8+/CD4+比例上升［1，7］。但過度體育鍛煉會對機體產(chǎn)生不利的影響，持續(xù)長時間、高強度的運動導致運動員淋巴細胞數(shù)目顯著減少［8，9］。有報道提出隨著運動負荷和時間的不斷增加，大鼠重要免疫器官中脾臟系數(shù)及胸腺系數(shù)持續(xù)下降［10］，還會進一步導致骨髓結構這一淋巴細胞發(fā)源地的破壞，直接損傷了T淋巴細胞增殖、分化和成熟過程及場所，這些生理結構及過程的破壞可能與機體免疫功能的下降密切相關。類似研究也探討了運動對脾臟淋巴細胞影響的可能性機制，有研究表明:適當有氧運動增強了脾臟的免疫功能，可能與運動導致脾臟交感神經(jīng)興奮性降低有關，交感神經(jīng)釋放兒茶酚胺類物質(zhì)能夠抑制淋巴細胞的免疫功能，即運動能夠調(diào)控神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡中的某些通路，進而影響機體的免疫功能［11］。

運動對免疫功能的影響是多方面的，不同運動強度、時間及頻率等會產(chǎn)生不同的免疫反應效果。我們的研究顯示中小強度的有氧運動有助于增強大鼠脾臟T 淋巴細胞的增殖活性、改善CD8+/CD4+T細胞比例。隨著實驗技術的不斷創(chuàng)新，運動影響機體免疫功能的更多機制有待被挖掘，從而更加全面地分析兩者之間的關系，合理指導人們的日常鍛煉。

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