多酚氧化酶的固定化及其酶學(xué)性質(zhì)的研究?

王 涵， 李 瑾,2， 程華麗， 馬啟敏,2??(中國海洋大學(xué) .環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，2.海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 26600)

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多酚氧化酶的固定化及其酶學(xué)性質(zhì)的研究?

王 涵1， 李 瑾1,2， 程華麗1， 馬啟敏1,2??
(中國海洋大學(xué) 1.環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，2.海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100)

以殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物為載體，采用吸附法和戊二醛交聯(lián)法固定多酚氧化酶(PPO)，考察了固定化酶的最佳制備條件及其酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明，吸附法固定化多酚氧化酶(A-PPO)的最佳制備條件為pH=5.0，酶與載體質(zhì)量比20mg/g，固定化時(shí)間6h，固定化酶的載酶量為12.12mg/g，單位載體酶活為12.76×103U/g，酶活回收率為81.7%。交聯(lián)法固定化酶(C-PPO)的最佳制備條件為pH=4.0，酶與載體質(zhì)量比75mg/g，固定化時(shí)間6h，固定化酶的載酶量為18.33mg/g，單位載體酶活為2.78×103U/g，酶活回收率為12.9%。A-PPO和C-PPO的最適酶促反應(yīng)條件為pH=8.0，溫度分別為40和30℃。與游離多酚氧化酶相比，固定化酶的操作穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性均有所提高。固定化酶重復(fù)使用5次后，可保留37.6%以上的相對(duì)酶活。PPO，A-PPO和C-PPO的米氏常數(shù)Km值分別為0.48，0.56和3.06mmol/L，較游離酶的Km值均有所增加；最大反應(yīng)速率Vmax分別為2.70，2.08和0.18U/g，較游離酶的Vmax值均有所減小。

多酚氧化酶； 殼聚糖； 固定化； 插層復(fù)合物； 酶學(xué)性質(zhì)

多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO)是一類高效酚類物質(zhì)降解酶，在有氧條件下能催化單酚類化合物羥基化生成鄰苯二酚，又能氧化鄰苯二酚脫氫生成醌，最終醌類自聚成不溶于水的高分子聚合物沉淀而被除去[1]。但游離酶在水溶液中穩(wěn)定性差、易流失、不可回收，處理成本過大，限制了其實(shí)際應(yīng)用[2]。酶的固定化技術(shù)可以使酶在保持其高效、專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時(shí)，還呈現(xiàn)操作、儲(chǔ)存穩(wěn)定性高，可多次重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，降低其使用成本。

殼聚糖是常用的酶固定化載體，其大分子鏈上的羥基(OH)和氨基(NH2)能與酶實(shí)現(xiàn)有效的結(jié)合[3]。但殼聚糖作為固定化酶載體時(shí)存在酸溶性、易降解、機(jī)械強(qiáng)度差等缺點(diǎn)，不宜直接作為固定化酶載體[4]。蒙脫土是一種層狀硅酸鹽，其片層厚度及層間距處于納米尺度，比表面積大，具有很好的物理吸附性[5]。但蒙脫土的功能基團(tuán)較少，酶的固定化只能通過吸附法來完成，導(dǎo)致載酶量低[6]。以溶液插層法制備殼聚糖/蒙脫土復(fù)合材料，并以此為多酚氧化酶的固定化載體，有望通過耦合作用，增加酶固定化載體的功能基團(tuán)及比表面積，提高酶的固定化效率和固定化酶的催化效率。

在固定化技術(shù)中，吸附法制備固定化酶，操作過程簡(jiǎn)單、操作條件溫和、不易破壞酶分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)以及活性中心的構(gòu)象，酶活回收率較高[7]，但只靠吸附作用固定化酶，結(jié)合力較弱，酶與載體結(jié)合不牢固而容易脫落。交聯(lián)法制備的固定化酶，酶與載體之間連接牢固，具有良好的穩(wěn)定性及重復(fù)使用性，但容易引起酶蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致酶的活性中心受到破壞，使酶的活力下降[8]。

本文以殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物為載體，通過吸附和戊二醛交聯(lián)兩種固定化方法制備固定化多酚氧化酶。考察了固定化酶的最佳制備條件及其酶學(xué)性質(zhì)，比較了固定化方法對(duì)固定化酶性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

多酚氧化酶(PPO，來源于蘑菇，活力單位為845 U/mg，購于Worthington Biochemical公司)；殼聚糖(CTS，重均分子量32.8×104，脫乙酰度85.6%，購于山東奧康生物科技公司)；鈉基蒙脫土(MMT，浙江三鼎科技有限公司，離子交換容量0.9mmol/g)；左旋多巴(L-DOPA，99%純度，購于阿拉丁試劑有限公司)，其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；THZ-82ALS氣浴恒溫振蕩器(金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.3 殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物的制備

殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物的制備參考文獻(xiàn)[9]：將4.0g蒙脫土加入100mL蒸餾水中，室溫?cái)嚢?h，使其充分溶脹。將3.300g殼聚糖溶于250mL 1% (v/v) 醋酸溶液中，充分溶解后用20% (w/v) NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至4.9。將上述殼聚糖溶液緩慢滴加入蒙脫土懸濁液中，60℃攪拌反應(yīng)6h。反應(yīng)結(jié)束后，分離、洗滌、烘干、研磨至200目即得殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物CTS/MMT。

1.4 多酚氧化酶的固定化方法

1.4.1 戊二醛交聯(lián)法 將0.02g CTS/MMT加入50 mL 1.0%(v/v)戊二醛溶液中，30℃攪拌交聯(lián)2h。產(chǎn)物依次用蒸餾水和磷酸鹽緩沖溶液(0.05mol/L，pH=7.0)洗滌，干燥備用。將戊二醛交聯(lián)CTS/MMT加入2mL一定pH值的多酚氧化酶緩沖溶液中，一定溫度下振蕩一定時(shí)間后，過濾，用磷酸鹽緩沖溶液(0.05mol/L，pH=7.0)洗滌至上清液中檢測(cè)不到多酚氧化酶，即得交聯(lián)法固定化多酚氧化酶C-PPO。

1.4.2 吸附法 將0.02g CTS/MMT加入2 mL一定pH值的多酚氧化酶緩沖溶液中，一定溫度下振蕩一定時(shí)間后，過濾，用磷酸鹽緩沖溶液(0.05mol/L，pH=7.0)洗滌至上清液中檢測(cè)不到多酚氧化酶，即得吸附法固定化多酚氧化酶A-PPO。

1.5 酶活性的測(cè)定

將一定體積的多酚氧化酶液或一定質(zhì)量的固定化多酚氧化酶加入到3mL L-DOPA(5.0mmol/L)磷酸鹽緩沖液(0.05mol/L，pH=7.0)中，25℃下進(jìn)行催化氧化反應(yīng)，測(cè)定上清液在475nm處吸光度值的變化，以此計(jì)算酶活。以每分鐘氧化4.4μmol/L的L-DOPA所需酶量為一個(gè)酶活單位[10]。固定化酶活用每克單位載體具有的酶活單位(U/g)[11]表示，酶活回收率以固定化酶的總活力占固定時(shí)所加酶液的總活力百分?jǐn)?shù)表示。相對(duì)酶活以同組酶活力最高為100%，其余數(shù)值與其對(duì)比，以百分?jǐn)?shù)表示。

1.6 酶蛋白含量的測(cè)定

多酚氧化酶蛋白含量的測(cè)定采用Bradford法[11]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。固定化酶載酶量以每克載體的酶蛋白量來表示(mg/g)。

2 結(jié)果與討論

2.1 多酚氧化酶的固定化

2.1.1 pH對(duì)固定化效果的影響 酶與固定化載體質(zhì)量比為40mg/g，室溫振蕩6 h時(shí)，緩沖溶液pH值對(duì)固定化酶的相對(duì)酶活與載酶量的影響如圖1所示。pH=2.0～3.0的緩沖溶液由0.05mol/L甘氨酸-鹽酸配制，pH=4.0的緩沖溶液由0.05mol/L醋酸-醋酸鈉配制，pH=5.0的緩沖溶液由磷酸二氫鈉-氫氧化鈉配制，pH=6.0～8.0的緩沖溶液由磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉配制。當(dāng)緩沖溶液的pH值分別為4.0和5.0時(shí)，C-PPO和A-PPO具有最大的相對(duì)酶活和載酶量。酶固定化過程的最佳pH值與酶的性質(zhì)直接相關(guān)[12]。多酚氧化酶的pI為4.5[13]，酶在其pI附近沒有凈電荷，因此最大載酶量及最大相對(duì)酶活均出現(xiàn)在其pI附近。最佳pH值時(shí)，固定化酶分子內(nèi)分子間作用力強(qiáng)，酶也保持了其最佳的球狀構(gòu)象而避免了其本身的伸展變性。戊二醛是一種雙功能反應(yīng)劑，可以在戊二醛的醛基與固定化載體中CTS的氨基和蛋白質(zhì)的游離氨基之間形成Schiff堿[14]。與A-PPO相比，C-PPO中由于戊二醛的加入，改變了固定化酶載體的化學(xué)環(huán)境及酶與載體間的作用方式，使得二者最佳固定化pH也不同(見圖1)。

圖1 pH值對(duì)固定化多酚氧化酶(a)相對(duì)酶活和(b)載酶量的影響

2.1.2 酶與載體質(zhì)量比對(duì)固定化效果的影響 多酚氧化酶液pH值分別為5.0(A-PPO)和4.0(C-PPO)，室溫振蕩6h時(shí)，酶與載體質(zhì)量比對(duì)固定化酶的相對(duì)酶活與載酶量的影響如2圖所示。固定化酶的相對(duì)酶活均隨酶與載體質(zhì)量比的增加呈先增后減的趨勢(shì)，當(dāng)酶與載體質(zhì)量比分別為20和75mg/g時(shí)，A-PPO和C-PPO的相對(duì)酶活達(dá)到最大值。一定質(zhì)量的CTS/MMT載體其活性位點(diǎn)的數(shù)目是一定的，載體的活性位點(diǎn)未飽和時(shí)，固定化酶的相對(duì)酶活隨酶與固定化載體質(zhì)量比的增加而增大；載體的活性位點(diǎn)達(dá)到飽和后，繼續(xù)增大酶與固定化酶載體的質(zhì)量比可能會(huì)增加酶分子之間的擁擠程度，使之與底物結(jié)合時(shí)的空間位阻增大，表現(xiàn)為相對(duì)酶活反而降低[15]。固定化酶的載酶量隨酶與載體質(zhì)量比的增加而增大，當(dāng)酶與載體質(zhì)量比分別為100和125mg/g時(shí)，A-PPO和C-PPO的載酶量達(dá)到最大，繼續(xù)增加酶與載體質(zhì)量比固定化載體的載酶量不再增加。

圖2 酶與載體質(zhì)量比對(duì)固定化酶(a)相對(duì)酶活和(b)載酶量的影響

2.1.3 固定化反應(yīng)時(shí)間對(duì)固定化效果的影響 多酚氧化酶液pH值分別為5.0(A-PPO)和4.0(C-PPO)，酶與載體質(zhì)量比分別為20 mg/g(A-PPO)和75 mg/g(C-PPO)時(shí)，固定化時(shí)間對(duì)固定化酶的相對(duì)酶活與載酶量的影響如圖3所示。固定化酶的相對(duì)酶活和載酶量隨固定化時(shí)間的增加而增大。固定化酶的相對(duì)酶活和載酶量在6 h時(shí)達(dá)到最大。此時(shí)，載體上的結(jié)合位點(diǎn)與酶反應(yīng)較充分，固定化酶的活性達(dá)到最大。當(dāng)固定化時(shí)間大于6 h時(shí)，載酶量不再有明顯增加，而相對(duì)酶活卻明顯下降，可能是因?yàn)楣潭ɑ瘯r(shí)間過長，已被固定在載體上的酶分子因部分發(fā)生結(jié)構(gòu)變化而失活[16]。

圖3 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶(a)相對(duì)酶活和(b)載酶量的影響

2.1.4 最佳固定化酶制備條件下多酚氧化酶的活性 A-PPO和C-PPO的最佳制備條件及固定化酶的載酶量和酶活測(cè)定結(jié)果列于表1中。C-PPO的每克單位載體的酶活在酶與載體質(zhì)量比為75 mg/g時(shí)達(dá)到最高，獲得最大酶活所需的加酶量遠(yuǎn)大于A-PPO，這可能是因?yàn)榕cA-PPO相比，C-PPO在酶的固定化過程中，載體上的醛基首先通過交聯(lián)作用與酶分子的氨基迅速結(jié)合，當(dāng)交聯(lián)位點(diǎn)飽和后，酶分子還可能會(huì)通過物理吸附固定在載體表面的活性位點(diǎn)，而A-PPO只通過物理吸附固定在載體表面的活性位點(diǎn)。最佳條件下制備的C-PPO載酶量略高于A-PPO，而A-PPO的每克單位載體酶活和酶活回收率均明顯高于C-PPO。這可能是因吸附法中固定化載體與酶的結(jié)合力主要為范德華力和氫鍵類非特異性物理吸附，能較好地保持酶的活性中心和高級(jí)結(jié)構(gòu)。而交聯(lián)法中，由于戊二醛既是固定化反應(yīng)的交聯(lián)劑，同時(shí)又是酶的變性劑，酶蛋白的功能基團(tuán)參與了反應(yīng)，引起酶蛋白的變性，使酶活性損失比較大[2]。

表1 固定化多酚氧化酶的最佳制備條件、載酶量及酶活

2.2 固定化多酚氧化酶的性質(zhì)

2.2.1 最適pH值 將游離和固定化多酚氧化酶分別加入不同pH值的L-DOPA緩沖溶液中反應(yīng)，測(cè)定相對(duì)酶活，考察固定化酶的最適酶促反應(yīng)pH值。如圖4所示，固定化酶與游離酶的相對(duì)酶活隨pH值的變化趨勢(shì)基本一致。pH=4.0～8.0時(shí)，固定化酶與游離酶的相對(duì)酶活均隨pH值的增加而增大，在pH=8.0時(shí)達(dá)到最大。當(dāng)pH>8.0時(shí)，相對(duì)酶活降低，多酚氧化酶固定化后相對(duì)于游離酶在更寬的pH范圍內(nèi)保持高的相對(duì)酶活。這可能是由于固定化載體CTS/MMT中游離氨基等活性基團(tuán)具有pH緩沖作用，使固定化酶微環(huán)境pH的變化小于溶液中的變化，減小了pH值變化對(duì)酶的影響，從而提高了固定化酶對(duì)pH變化的適應(yīng)范圍[12]。

圖4 游離和固定化多酚氧化酶酶促反應(yīng)的最適pH值

2.2.2 最適溫度 游離與固定化多酚氧化酶的最適酶促反應(yīng)溫度如圖5所示。隨著溫度的升高，游離酶和固定化酶相對(duì)酶活均呈先增后減的趨勢(shì)。游離酶和C-PPO在30℃時(shí)相對(duì)酶活達(dá)到最大，A-PPO的相對(duì)酶活在40℃時(shí)達(dá)到大。在15～50℃的溫度范圍內(nèi)，固定化酶均保持了56.7%以上的相對(duì)酶活，較游離酶明顯提高，表明多酚氧化酶固定化后有較好的熱穩(wěn)定性，這可能是由于酶分子固定在載體上后，其分子構(gòu)象的變化自由度降低，構(gòu)象比較穩(wěn)定，從而保持較好的溫度適應(yīng)性[17]。

圖5 游離和固定化多酚氧化酶酶促反應(yīng)的最適溫度

2.2.3 固定化多酚氧化酶的操作穩(wěn)定性 將游離和固定化多酚氧化酶置于不同 pH值的緩沖溶液中，于一定溫度下保溫2 h，冷卻后測(cè)定相對(duì)酶活，考察其熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性(見圖6)。當(dāng)游離和固定化多酚氧化酶在pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液中于不同溫度下保溫2h后，其相對(duì)酶活如圖6(a)所示。在20～40℃的溫度范圍內(nèi)，游離和固定化多酚氧化酶具有相當(dāng)?shù)南鄬?duì)酶活。隨著溫度的繼續(xù)升高，游離酶的相對(duì)酶活急劇下降，50℃時(shí)相對(duì)酶活僅為11.8%，而固定化酶仍保持60.5%以上的相對(duì)酶活。多酚氧化酶固定化后熱穩(wěn)定性得到明顯提高，CTS/MMT固定化載體可能較好地保持了酶的三維結(jié)構(gòu)，保證酶不被環(huán)境溫度的影響而改變酶的構(gòu)象[18]。

將游離和固定化多酚氧化酶分別置于pH=3.0～9.0的緩沖溶液中，20℃保溫2h后測(cè)定相對(duì)酶活，結(jié)果如圖6(b)所示。游離和固定化多酚氧化酶均在pH=7.0時(shí)顯示了最大相對(duì)酶活。與游離酶相比，固定化酶在酸性條件下的pH穩(wěn)定性明顯提高。當(dāng)pH=3.0時(shí)，A-PPO和C-PPO的相對(duì)酶活分別為90.2%和73.7%，而游離酶的相對(duì)酶活僅為34.1%。

圖6 游離和固定化多酚氧化酶的熱穩(wěn)定性(a)和pH穩(wěn)定性(b)

2.2.4 游離酶和固定化酶的貯存穩(wěn)定性 將游離和固定化多酚氧化酶分別貯存于4℃的磷酸鹽緩沖液(0.05mol/L，pH=7.0)中，在一定時(shí)間間隔內(nèi)測(cè)定相對(duì)酶活，考察酶的貯存穩(wěn)定性，結(jié)果如圖7所示。游離和固定化多酚氧化酶的相對(duì)酶活均隨貯存時(shí)間的延長而下降。A-PPO和C-PPO在貯存15d后，相對(duì)酶活基本保持不變，30d后相對(duì)酶活保持57.4%和51.3%，而游離酶在30d后基本喪失酶活。結(jié)果表明，固定化載體CTS/MMT的空間結(jié)構(gòu)對(duì)多酚氧化酶具有很好的保護(hù)作用，酶與載體之間的相互作用使得酶分子結(jié)構(gòu)剛性增強(qiáng)，貯存穩(wěn)定性得到明顯的提高[17,19]。

圖7 游離和固定化多酚氧化酶的貯存穩(wěn)定性

2.2.5 固定化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性 一次酶催化反應(yīng)完成后(pH=7.0，20℃，5min)，離心收集固定化酶，用磷酸鹽緩沖溶液(0.05mol/L，pH=7.0)充分洗滌，重新進(jìn)行酶催化反應(yīng)，測(cè)定固定化酶的相對(duì)酶活，考察固定化酶的重復(fù)使用性。如圖8所示，A-PPO和C-PPO重復(fù)使用5次后仍分別保持了37.6%和46.5%的相對(duì)酶活，表明固定化酶有較好的重復(fù)使用性。

圖8 固定化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性

2.2.6 固定化酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì) 以不同濃度(0.5～5.0mmol/L)的L-DOPA磷酸鹽緩沖液(0.05mol/L，pH=7.0)為底物，考察了固定化多酚氧化酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。游離及固定化多酚氧化酶的Lineweaver-Burk曲線線性關(guān)系良好(R2>0.9552)，表明水解L-DOPA均遵循Michaelis-Menten方程。游離和固定化酶的米氏常數(shù)Km值和最大反應(yīng)速度Vmax值列于表2中。Km值表明了酶與載體之間的相互作用，Km值越小，酶可以在相對(duì)低的底物濃度條件下達(dá)到最大反應(yīng)速度[18]，表明酶與底物的親和力越好。如表2所示，兩種固定化酶的Km值均大于游離酶，即固定化酶與底物的親和力均小于游離酶。表明多酚氧化酶固定化后，酶分子的空間結(jié)構(gòu)受到限制，活性部位無法完全與底物接觸。同時(shí)，載體的空間結(jié)構(gòu)造成的空間障礙和底物的擴(kuò)散限制也使酶與底物的親和力降低。比較兩種不同方法的固定化酶可知，A-PPO的Km值低于C-PPO，而具有與游離酶相近的Km值，表明A-PPO比C-PPO對(duì)底物有更好的親和力，使用吸附法在CTS/MMT載體上固定多酚氧化酶能很好地保持酶的三維結(jié)構(gòu)使得固定化酶的活性中心與底物的接觸程度并沒有因?yàn)槊傅鞍追肿拥墓潭ɑ鴾p弱。

酶的固定化使其鄰域的底物濃度與游離酶也明顯不同，且固定化酶催化反應(yīng)體系中擴(kuò)散限制的存在，使得固定化酶的Vmax值均低于游離酶。同時(shí)，A-PPO的Vmax值高于C-PPO且具有與游離酶相近的Vmax值，表明交聯(lián)法固定多酚氧化酶可能使其空間構(gòu)象發(fā)生了改變，載體上酶分子的自由度小于A-PPO，催化速率相對(duì)較低。

表2 游離酶和固定化多酚氧化酶的性質(zhì)參數(shù)

3 結(jié)論

(1)以殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物(CTS/MMT)為載體，采用吸附和戊二醛交聯(lián)2種方法固定化多酚氧化酶。A-PPO的最佳制備條件為pH=5.0，酶與載體質(zhì)量比20mg/g，固定化時(shí)間6h；固定化酶的載酶量為12.12mg/g，單位載體酶活為12.76×103U/g，酶活回收率達(dá)81.7%。C-PPO的最佳制備條件為pH=4.0，酶與載體質(zhì)量比75mg/g，固定化時(shí)間6h；固定化酶的載酶量為18.33mg/g，最大單位載體酶活為2.78×103U/g，酶活回收率為12.9%。

(2)固定化多酚氧化酶的最適酶促反應(yīng)pH均為8.0，C-PPO的最適酶促反應(yīng)溫度為30℃，A-PPO的最適酶促反應(yīng)溫度為40℃。與游離多酚氧化酶相比，固定化酶的操作和貯存穩(wěn)定性均有所提高。固定化酶重復(fù)使用5次后，仍保留37.6%以上的相對(duì)酶活。

(3)多酚氧化酶固定于CTS/MMT載體后，米氏常數(shù)Km值均增大,而最大反應(yīng)速度Vmax均減小。與戊二醛交聯(lián)法相比，吸附法制備的固定化多酚氧化酶與底物的親和力更好，最大反應(yīng)速率更大。

(4)比較兩種酶的固定化方法，A-PPO制備過程簡(jiǎn)單，固定化酶的單位載體酶活和酶活回收率均高于C-PPO，而C-PPO的載酶量和重復(fù)使用穩(wěn)定性都優(yōu)于A-PPO。戊二醛交聯(lián)劑的使用可能引起了PPO高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，而導(dǎo)致了酶活的降低。因此，將PPO固定于殼聚糖/蒙脫土插層復(fù)合物上宜采用吸附法。

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責(zé)任編輯 龐 旻

Immobilization of Polyphenol Oxidase and Its Enzymatic Properties

WANG Han1, LI Jin1,2, CHENG Hua-Li1, MA Qi-Min1,2

(1. College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China; 2. The Key Laboratory of the Marine Environment and Ecology, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266100, China)

Polyphenol oxidase (PPO) was immobilized on chitosan/montmorillonite intercalation composites by adsorption and glutaraldehyde cross-linking. The immobilization conditions and enzymatic properties were investigated in detail. Optimal preparation conditions of the immobilization of polyphenol oxidase by adsorption (A-PPO) were pH=5.0, enzyme/support weight ratio 20mg/g, immobilization time 6 h. And the protein loading yield of A-PPO was 12.12mg/g, enzyme activity of the unit support 12.76×103U/g, and activity recovery 81.7%. Optimal preparation conditions of enzyme immobilizated by glutaraldehyde cross-linking (C-PPO) were found to be pH=4.0, enzyme/support weight ratio 75mg/g, immobilization time 6 h. The protein loading yield of C-PPO was 18.33mg/g, enzyme activity of the unit support 2.78×103U/g, and activity recovery 12.91%. A-PPO and C-PPO showed the optimum activity at pH=8.0, and 40℃ and 30 ℃, respectively. Compared with free PPO, immobilization enhanced enzyme stability against changes in pH and temperature. Immobilized PPO retained more than 37.6% of its initial activity after five cycles. A-PPO and C-PPO had a higherKmvalues (Michaelis constant) than free enzyme, and the values were 0.56, 3.06 and 0.48mmol/L, respectively. The maximum reaction rateVmaxof A-PPO and C-PPO were decreased compared with free enzyme, and determined as 2.08, 0.18 and 2.70U/g, respectively.

polyphenol oxidase；chitosan；immobilization；intercalation composites；enzymatic properties

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41106067)；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2010BQ013)；青島市基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(13-1-4-252-jch)；中國海洋大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(201013032)資助

2014-05-27；

2014-10-17

王 涵(1991-)，女，碩士生。E-mail:zghywh0122@163.com

?? 通訊作者： E-mail: maqimin@ouc.edu.cn

O625.31

A

1672-5174(2015)08-090-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20140184