半滑舌鰨IGF1基因編碼區(qū)的多態(tài)性與生長性狀及表達的相關(guān)性分析?

黃政舉， 何 峰， 溫海深， 李吉方， 司玉鳳， 趙君麗， 任源遠， 邢 德， 徐捷凱(中國海洋大學水產(chǎn)學院， 山東 青島 266003)

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半滑舌鰨IGF1基因編碼區(qū)的多態(tài)性與生長性狀及表達的相關(guān)性分析?

黃政舉， 何 峰??， 溫海深， 李吉方， 司玉鳳， 趙君麗， 任源遠， 邢 德， 徐捷凱
(中國海洋大學水產(chǎn)學院， 山東 青島 266003)

胰島素樣生長因子1(IGF1)在魚類生長內(nèi)分泌調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本研究檢測了半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)IGF1基因外顯子的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，分析其基因型與生長性狀、血液生化指標的關(guān)系及基因表達的相關(guān)性。結(jié)果顯示，IGF1基因外顯子5的884bp處一個位點發(fā)生突變，此突變處堿基C變?yōu)锳，即C884A，此突變發(fā)生于終止密碼子之后，并且發(fā)生在WD40結(jié)構(gòu)域，可能會對基因的轉(zhuǎn)錄、表達和生長性狀產(chǎn)生影響。此位點與體重(P<0.05)、去內(nèi)臟重(P<0.05)呈顯著相關(guān)性，AA基因型的體重和去內(nèi)臟重顯著高于AB基因型(P<0.05)，AA基因型的尿素含量顯著大于AB基因型(P<0.05)，AA基因型的mRNA表達量也顯著高于AB基因型(P<0.05)。研究表明，IGF1基因編碼區(qū)的多態(tài)性對半滑舌鰨的生長性狀、血液生化指標和基因表達有顯著影響，IGF1基因可以作為選擇育種的一種分子標記，從遺傳學的角度輔助半滑舌鰨優(yōu)良品種的分子選育。

IGF1基因； 半滑舌鰨； 單核苷酸多態(tài)性； 血液生化； 生長性狀； 基因表達

半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)主要分布在中國的渤海和黃海，是一種暖溫性近海大型底層魚類，其味道鮮美、經(jīng)濟價值較高，近年來已成為中國重要的養(yǎng)殖品種之一[1]。半滑舌鰨的雄性個體比雌性個體小的多，因此人們需要優(yōu)選雄性個體，以加速雄性個體的品質(zhì)改良[2]。單核苷酸多態(tài)性被廣泛應用于相關(guān)的候選基因的研究，是第三代重要的遺傳標記技術(shù)[3]。

生長激素-胰島素樣生長因子(GH-IGF)系統(tǒng)在調(diào)控脊椎動物生長的過程中扮演著重要的角色。生長激素軸(Somatotropicaxis)是由下丘腦-垂體-生長激素-靶器官上有關(guān)激素及其受體所組成的神經(jīng)內(nèi)分泌軸[4]。垂體產(chǎn)生的生長激素(GH)首先與生長激素結(jié)合蛋白(GHBP)結(jié)合，經(jīng)血液運至肝細胞，然后與肝細胞上的受體相結(jié)合，刺激IGF1的產(chǎn)生[4]。然后IGF1與IGF1結(jié)合蛋白結(jié)合，經(jīng)血液運送至各組織器官，與各組織器官上的IGF1受體相結(jié)合，促進細胞的生長與分化[4]。在魚類，IGF主要受GH在生長促進方面的影響并且受生長的自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌方面的調(diào)控[5-6]。GH能夠促進各種組織中IGF1和IGF2的合成。一些研究顯示，肝中注射GH可以提高虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctateus)和黑鯽(Carassiuscarassius)的肝中IGF1和IGF2的合成[7-9]。IGF1和IGF2分別與受體結(jié)合，通過PI3K/AKT/TOR和MAPK/ERK 2條信號通路來促進骨骼肌的生長[10]。

IGF1在生長和發(fā)育的過程中起著重要的作用。IGF1基因的單核苷酸多肽性可以影響動物的代謝、生長、壽命和疾病等相關(guān)性狀[11-12]?；虻亩鄳B(tài)性在哺乳動物(尤其是家畜、家禽)中研究的較多，如印度肉雞IGF1基因啟動子的多態(tài)性對于其基因表達和生長有顯著影響[13]。一年生菜牛的IGF1基因的多態(tài)性與體重有顯著關(guān)系[12]。而魚類IGF1基因的報道還比較少，文獻[14]研究了黑鱸(Micropterussalmoides)IGF1基因5′端區(qū)域的多態(tài)性與生長性狀有顯著相關(guān)性[14]。Ma等人克隆了半滑舌鰨IGF1基因并研究了其mRNA的表達[15]。IGF1的主要功能是調(diào)節(jié)生長和發(fā)育，其mRNA表達量高意味著生長能力強。如日本花鱸(Lateolabraxjaponicus)IGF1基因mRNA的表達與生長性狀有著重要的關(guān)系[16]。銀鮭(Oncorhynchuskisutch) 肝中IGF1基因mRNA的表達水平也與生長性狀顯著相關(guān)[17]。這些結(jié)果表明，IGF1基因mRNA的表達水平可能是生長的一個指標，同時也說明IGF1基因可以作為動物生長發(fā)育的候選基因。在魚類生長指標中，血液指標是魚類生長的一個很重要的反映特征，血液反映了魚類的生理生化狀態(tài)，也可以評價其健康狀況、營養(yǎng)水平以及環(huán)境中水質(zhì)的情況等。性別、種類、年齡、選用的飼料和疾病等都可以影響魚類血液的生理生化指標[18]?；蛐偷母淖儗︳~類血液生理生化指標也可能產(chǎn)生影響。因此，研究魚類血液生化指標對于研究魚類的生長也很重要。

半滑舌鰨IGF1基因(GenBank Accession No. FJ608667.1)是由5個外顯子組成的，包含937個核苷酸，編碼197個氨基酸。目前，還沒有半滑舌鰨IGF1基因多態(tài)性的報道，本研究的目的是尋找半滑舌鰨IGF1基因多態(tài)性，研究其對半滑舌鰨的生長性狀、血液生化、基因表達的影響，以篩選出大量的雄性優(yōu)良品種，來改善遺傳資源。

1 材料與方法

1.1 材料

半滑舌鰨來自于青島嘉洋高新水產(chǎn)育苗養(yǎng)殖基地。隨機選取親本來源相同的72尾同齡的二齡雄魚，這些雄魚具有類似的尺寸，平均體長32.00cm和平均體重225.00g。將其飼養(yǎng)在自然海水中(溫度(20±0.5) ℃；O2≥4ng/mL；光周期(H∶L=14∶10))，喂食商業(yè)飼料。

在實驗室暫養(yǎng)1d，不進行投喂。對魚進行麻醉，靜脈取血。解剖各組織器官于分子管中，放于-80 ℃，便于隨取隨用，同時稱量魚的肝重、性腺重和去內(nèi)臟重。計算肝重指數(shù)、性腺指數(shù)：

肝重指數(shù)HSI=[肝重/(體重-去內(nèi)臟重)]×100，

性腺重指數(shù)GSI=[性腺重/(體重-去內(nèi)臟重)]×100。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和PCR擴增 用酚-氯仿法提取肌肉組織中的基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA完整性，并用超微核酸蛋白測定儀(BD-1000)測量DNA的濃度。根據(jù)Genebank中IGF1基因的cDNA的序列，用primer premier 5軟件設計了5個引物(見表1)。PCR總反應體系共25 μL，包括模板DNA 1 μL，dNTP 0.2 mmol/L，10×PCR buffer 2.5 μL，引物各0.20 mmol/L和Easy Taq DNA酶0.5 U。反應程序為雙鏈DNA，94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，退火45 s，72 ℃延伸45 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進行檢測。

表1 半滑舌鰨IGF1基因外顯子的擴增引物

1.2.2 PCR-SSCP檢測 6 μL PCR產(chǎn)物與10.8 μL變性buffer(98%去離子甲酰胺,0.01 mol/L EDTA, 0.025%亞甲基藍,0.025%溴酚藍，0.2%甘油)混合，在PCR儀中98 ℃ 10 min，然后立即放于冰箱-20 ℃靜置10 min以上。變性的PCR產(chǎn)物進行10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，在冰箱4 ℃下電泳7～10h。然后電泳結(jié)果進行銀染，進行DNA分型。剩余的PCR產(chǎn)物用DNA膠回收試劑盒(TIANGEN，China)進行純化,藍白斑篩選后進行不同基因型的測序。

1.2.3 激素和血液生理生化指標測定 用125I放射免疫測定法檢測血液中的四碘甲狀腺原氨酸(T3)和三碘甲狀腺原氨酸(T4)水平[19]。另外，作者用自動化分析儀檢測了一些血液生化指標像總蛋白、血清白蛋白、血尿酸、尿素、總膽固醇、甘油三酸酯、葡萄糖、鈣和磷(邁瑞公司BS-180,中國)。

1.2.4 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄(RT-PCR) 用RNA提取試劑盒從50 mg肝組織中提取總RNA含量(TakaRa,日本)，用分光光度計檢測RNA濃度。A260/A280在1.8～2.0之間。1 μL RNA由反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA(Bio-Rad)。使用反轉(zhuǎn)錄引物(上游引物：5′-AGTCCTTCGCTGCTGTT-3′，下游引物：5′-CCCTGTTGGTTGGCTTA-3′)進行基因148個核苷酸的擴增。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，包括2 μL cDNA模板，每個樣本0.4 μL反轉(zhuǎn)錄引物，10 μL SYBR熒光染料，0.4 μL ROX參照染料，0.6 μL RNA滅菌水。反應條件為95 ℃30 s，40個循環(huán)95 ℃5 s變性，60 ℃34 s退火，72 ℃30 s延伸。每個樣重復3次，使用18s作為參照基因(引物：上游:5′-GAATTGACGGAAGGGCACCACCAG-3′;下游:5′-ACTAAGAACGGCCATGCACCACCAC-3′)[20]。相關(guān)表達由2-ΔΔCt方法計算獲得，計算結(jié)果與18s核糖體RNA進行對比。

1.2.5 統(tǒng)計學分析 利用Stat View軟件9.0版，通過單因素方差分析(one-way ANOVA)其突變位點和相關(guān)[21]。利用鄧肯多重比較分析不同基因型均值的差異性。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增

提取72尾半滑舌鰨基因組DNA為模板，利用設計的引物進行PCR擴增。各引物均得到了特異性條帶，其中只有引物5在后續(xù)的實驗中檢測到多態(tài)性，所以本文只對引物5進行詳細介紹，其他不再贅述。引物5的PCR擴增結(jié)果如圖1所示。擴增產(chǎn)物單一，且無非特異性擴增，可以進行下一步的SSCP分析。

圖1 外顯子5引物的PCR擴增結(jié)果

2.2 PCR-SSCP檢測

采用PCR-SSCP法檢測IGF1基因的單核苷酸多態(tài)性。從SSCP膠圖中發(fā)現(xiàn)引物5的擴增片段都存在3種基因型，根據(jù)后續(xù)的測序結(jié)果將3種基因型分別定義為AA、AB和BB型，其SSCP分析結(jié)果及3種基因型的定義如圖2所示?；蛐皖l率和等位基因頻率見表2，AA、AB和BB的基因型頻率分別為22.22%、61.11%和16.67%。A和B的等位基因頻率分別為52.78%和47.22%。

圖2 IGF1基因的基因分型

位點Locus基因頻率Genotypesfrequencies/%AAAB等位基因頻率Allelefrequencies/%BBABSNP22．2261．1116．6752．7847．22

2.3 各基因型序列

通過銀染檢測到外顯子5具有多態(tài)性，經(jīng)進一步測序檢測到突變位點，發(fā)現(xiàn)有1個SNP突變，即C884A。AA、AB和BB 3種基因型的序列如圖3所示。

圖3 IGF1基因的AA、AB和BB基因型的序列測定

2.4 突變位點基因結(jié)構(gòu)位置

通過(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/lexington/lexington.cgi?cachecdqs=QM3-data_cache-25 8478F792FA36ED-5284342CEECE1)預測IGF1基因的結(jié)構(gòu)(見圖4)，在850～1075bp之間有一個結(jié)構(gòu)域WD40。

2.5 基因型與性狀的相關(guān)分析

作者做了72條魚和11個生長性狀之間關(guān)系的分析，了解到基因型與體重(P<0.05)和去內(nèi)臟重(P<0.05)顯著相關(guān)(見表3)。AA基因型的體重和去內(nèi)臟重顯著高于AB基因型(P<0.05)(見圖5)。

圖4 WD40結(jié)構(gòu)位置的預測

性狀TraitsIGF1三碘甲狀腺原氨酸T3①/ng·mL-1四碘甲狀腺原氨T4②/μg·dL-1體長/cmLength體重/gWeight體高/cmHeightFvaluePvalueFvaluePvalueFvaluePvalueFvaluePvalueFvaluePvalueFvaluePvalue1．2570．3000．8260．4480．9080．4141．3960．2643．5290．043?2．0340．149性狀Traits去內(nèi)臟重③/g頭長/cmLiverweight眼徑/cmGonadweight肝臟指數(shù)HSI性腺指數(shù)GSIFvaluePvalueFvaluePvalueFvaluePvalueFvaluePvalueFvaluePvalue3．7110．037?0．3240．7261．0290．3702．3280．1150．5000．612

注：*：P<0.05.①Triiodothyrontne；②Tetraiodothyronine；③Weight without viscera

(誤差線上的不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Different letters above the error bars means significant difference atP<0.05.)

圖5 不同基因型生長性狀的多重比較

Fig.5 Multiply comparison of growth trait among different genotypes

2.6 血液生化與生長性狀的相關(guān)分析

通過分析顯示AA基因型的尿素(UREA)值顯著高于AB基因型(P<0.05)，其結(jié)果列于表4。

2.7 基因型與表達的相關(guān)分析

肝中IGF1基因外顯子5各基因型的表達量進行比較分析，結(jié)果顯示AA基因型的表達量顯著高于AB基因型(P<0.05)(見圖6)。

3 討論

生長激素(GH)/胰島素樣生長因子1(IGF1)軸是人類體細胞生長的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并且其基因在研究生長個體的突變上是重要的候選基因[22]。IGF是一類多肽，它調(diào)節(jié)著脊椎動物生長和細胞代謝的各個階段[14]。特別是IGF1，它在脊椎動物代謝活動，生長和發(fā)育中扮演著重要的角色。在魚類，IGF1在生長的調(diào)控方面也起到了重要的作用[23]。

對于生長軸基因，文獻[21]已經(jīng)報道了半滑舌鰨GH基因和生長激素受體基因(GHR)的多態(tài)性對于生長性狀的顯著影響，而對于IGF1基因研究的還比較少。黑鱸IGF1基因5′端區(qū)域的多態(tài)性與生長性狀有著密切的關(guān)系[14]。印度山羊在不同年齡階段IGF1基因的單核苷酸多態(tài)性對生長性狀有著重要作用[24]。類似的，在本文的研究中，發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨IGF1基因外顯子5上發(fā)生突變，即C884A，與體重和去內(nèi)臟重有著顯著的關(guān)系(P<0.05)。因為遺傳多態(tài)性可能對編碼蛋白質(zhì)區(qū)域以外的部分造成影響，非編碼序列的RNAs也可能對基因表達產(chǎn)生影響[25]。類跨膜通道蛋白1(TMC1)基因外顯子3的非編碼序列的突變被證明與伊朗耳聾家族有關(guān)[26]。與本研究相類似，突變位點位于終止密碼子之后，但是仍對生長性狀，血液生化和基因表達產(chǎn)生顯著影響。特別是該位點位于WD40區(qū)，這種典型的結(jié)構(gòu)：從N端開始，有11～24個生長激素二肽的殘基，從C端開始有40個色氨酸-天冬氨酸的殘基所以叫WD40[27]。在GH和WD之間有一個保守的核心，持久穩(wěn)定地發(fā)揮著促進作用，像螺旋槳一般，蛋白質(zhì)通過這個平臺可以穩(wěn)固或可逆地結(jié)合在一起。這個像螺旋槳一樣的核心實際上是由幾葉“槳片”組成的，每葉“槳片”又是由四股反向平行的Β折疊片組成的；作者猜測這些物質(zhì)或多或少通過重復(這種復制拷貝是可以觀察到的)二聚化的形式來形成更大的結(jié)構(gòu)；每一個WD40重復序列形成了一葉“槳片”中的三股，和下一葉中的一股；C端的WD40重復序列完成了第一個WD40重復結(jié)構(gòu)的“槳片”結(jié)構(gòu)，這樣一個閉合環(huán)狀的結(jié)構(gòu)就是“螺旋槳”的一部分。“螺旋槳”頂部和底部表面的殘基將被用于調(diào)節(jié)與其它蛋白或配體的相互作用[27]。884 bp處C→A的突變正好位于WD結(jié)構(gòu)域，其在生物體中主要參與信號轉(zhuǎn)導，轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及RNA剪切等基因調(diào)控作用。真核細胞中WD40結(jié)構(gòu)域在信號轉(zhuǎn)導過程中，參與前體mRNA的加工以及細胞骨架的集合裝配等多種多樣的功能，因此其位點的突變必然對基因的轉(zhuǎn)錄和表達產(chǎn)生作用[28]。

表4 不同基因型生理生化指數(shù)的相關(guān)性

Note： *：P<0.05

(誤差線上的不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Different letters above the error bars means significant difference atP<0.05.)

圖6 不同基因型的相對表達量

Fig.6 Relative expression of different genotypes

在早期的研究中，肝在總蛋白、血清白蛋白、血尿酸、尿素、總膽固醇、甘油三酸酯、葡萄糖、鈣和磷的基礎代謝上起著關(guān)鍵的作用，肝的損傷可能會改變血液生化指標，并且肝的損傷會影響一系列結(jié)構(gòu)和生化組成上的改變[29]，這與本文的研究相一致。肝中提取IGF1基因序列發(fā)生突變對于血液生化有著顯著的影響，所以，AA基因型的尿素含量顯著高于AB基因型(P<0.05)。這可能是因為肝中IGF1基因型的改變影響著其DNA的結(jié)構(gòu)，對代謝(尿素)產(chǎn)生影響。

Nolten等報道在心臟、鰓、肌肉、腸和肝中都發(fā)現(xiàn)了IGF1肽，但實時定量PCR分析顯示，肝比其它的組織有更高的IGF1基因表達量[30]。另外，IGF1基因的表達量的降低是胎兒生長受限的關(guān)鍵因素[31]。對于兔子來說，其高生長的個體會有更高的IGF1基因的表達量[32]。這些研究都表明，IGF1基因的表達與生長是正相關(guān)關(guān)系。Carnevali等研究了黑鱸、斑點叉尾鮰、和羅非魚(Tilapia)的IGF1基因，結(jié)果都表明，IGF1基因有著更高的mRNA的表達量的基因型有著更高的生長表現(xiàn)型[33-35]。這與本文的研究一致，AA基因型的體重和去內(nèi)臟重顯著高于AB基因型(P<0.05)，這和AA基因型的基因表達量也顯著高于AB基因型(P<0.05)是一致的。這些研究都更加確認了肝IGF1在半滑舌鰨生長的過程中起了關(guān)鍵的作用。盡管外顯子5上的突變發(fā)生在終止子之后，但其仍然對基因表達有著很大的調(diào)控作用，所以在表現(xiàn)型上才有很大的差別?？梢赃x擇AA基因型進行培育，擴大養(yǎng)殖，從而培育出更加優(yōu)良的性狀。

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責任編輯 朱寶象

The Polymorphism in the Coding Region ofIGF1 Related to mRNA Expression Pattern and Growth Traits of Half-Smooth Tongue Sole (Cynoglossussemilaevis)

HUANG Zheng-Ju, HE Feng, WEN Hai-Shen, LI Ji-Fang, SI Yu-Feng, ZHAO Jun-Li, REN Yuan-Yuan, XING De, XU Jie-Kai
(College of Fishery, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Insulin-like growth factor 1 (IGF1) is involved in the growth endocrine regulation of many fish species. The purpose of this study was to detect the single nucleotide polymorphism (SNP) in the coding region ofIGF1 and analyze the relationships among genotypes, growth traits, serum levels of physiological and biochemical indexes and gene expression in half smooth tongue sole (Cynoglossussemi-laevis). A mutation at 884 bp position was detected in exon 5 ofIGF1, which was named C884A. This mutation occurred after termination codon in the structure of WD40 domain, thus influenced the transcription, growth characteristics among others. This mutation has significant correlations with body weight (P<0.05) and viscera weight (P<0.05). AA genotype was significantly higher than AB genotype in weight (P<0.05) and viscera weight (P<0.05). The UERA content of AA genotype was significantly higher than the AB genotype (P<0.05). At the same time, the expression of AA genotype was also significantly higher than AB genotype (P<0.05). These results indicated that the polymorphism ofIGF1 in encoding region was significantly associated with the growth traits, blood physiological and biochemical indexes and gene expression in half smooth tongue. The mutation can be used as a molecular marker for selection breeding. Our findings may assist molecular breeding of good varieties from a genetic perspective and improve the production in half smooth tongue sole.

IGF1 gene； half-smooth tongue sole； SNPS； biochemical index； growth trait； gene expression

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2012AA10A403)；國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201310423043)資助

2014-06-17；

2014-09-25

黃政舉(1987-)，女，碩士生，研究方向：魚類生理與繁育。

?? 通訊作者： E-mail:hefengouc@ouc.edu.cn

S917.4

A

1672-5174(2015)08-019-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20140194