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    NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18軸在大鼠膿毒癥急性腎損傷中的作用

    2015-03-18 12:22:14穆曉琨
    安徽農(nóng)業(yè)科學 2015年32期
    關(guān)鍵詞:盲腸膿毒癥試劑盒

    穆曉琨,畢 琳

    (1.肇慶學院生命科學學院,廣東肇慶526061;2.四川省犍為縣動物疫病預防控制中心,四川樂山614400)

    急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)原名急性腎衰竭,是一種涉及多學科的臨床常見危重病癥,該疾病突發(fā)性高,病程進展快,死亡率高,且發(fā)病率逐年上升[1]。AKI可由感染、燒傷、腎動脈狹窄等各種原因引起。研究表明,藥物是導致AKI的首位病因,濫用藥物是急性腎損傷的一大誘因,在所有的急性腎臟損傷患者中膿毒癥是臨床誘發(fā)AKI的最重要原因之一[2-3]。膿毒癥是病原微生物侵入機體所致的全身炎癥反應綜合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS),臨床上證實有細菌存在或有高度可疑感染灶,可引起多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS),本質(zhì)上而言膿毒癥是機體對感染性因素的反應。一旦膿毒癥合并AKI,死亡率將高達70%[4]。因此,膿毒癥致AKI是危重急救醫(yī)學和腎臟病學著重解決的難題。

    Nod樣受體蛋白3(NLRP3)是一種存在于細胞胞漿中的多蛋白復合物,主要是由NLRP3、ASC和Caspase-1相互結(jié)合形成,是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分[5-7]。核心蛋白NLRP3被激活后,通過銜接蛋白ASC以及無活性的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1(caspase-1),形成 NLRP3炎癥復合體,進而活化caspase-1,切割I(lǐng)L-18和IL-1β的前體,使其成

    熟并釋放。研究表明,NLRP3炎癥小體與多種代謝性疾病有密切關(guān)系,如阿爾茨海默病、2型糖尿病、動脈粥樣硬化等[8-9]。但是,迄今為止NLRP3炎癥小體的具體運作模式尚不清楚。筆者通過盲腸結(jié)扎穿孔(Cecal ligation and puncture,CLP)模型構(gòu)建大鼠膿毒癥AKI模型并使用相關(guān)分子生物學手段,初步研究證實了NLRP3炎癥小體在大鼠膿毒癥AKI過程中的作用,探討其防治膿毒癥所致AKI的可能機制。

    1 材料與方法

    1.1 藥品與試劑 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司;考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒,購自北京普利來公司;大鼠尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)試劑盒,購自南京建成生物工程研究所;蘇木精和伊紅,購自中國醫(yī)藥上?;瘜W試劑公司;兔抗鼠多克隆抗體NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18 和 β-actin均購自美國Abcam公司;大鼠血清IL-1β和IL-18 ELISA檢測試劑盒購自美國R&D公司。

    1.2 動物及分組 健康雄性SD大鼠48只,7~8周齡,體質(zhì)量250~300 g。所有大鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為假手術(shù)組(n=18)和CLP組(n=30),2組再隨機平均分為6個時間點(0、3、6、12、18、24 h)。

    1.3 模型制備 采用盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)法制備膿毒癥模型。大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛溶液(3.5 ml/kg)麻醉,腹壁正中切開2 cm,拉出盲腸后在盲腸總長度50%處結(jié)扎,用25號針頭在結(jié)扎線下5 mm處貫穿盲腸1次后放回盲腸并關(guān)腹。假手術(shù)組除不結(jié)扎和盲腸穿刺外,其余操作同CLP組。術(shù)后將大鼠分籠飼養(yǎng),禁食不禁水。

    1.4 樣本采集 各組在相應時間點摘除存活大鼠眼球取血2 ml,以3 000 r/min離心10 min后留取血清備用。大鼠處死后,開腹,開放腎靜脈,用4℃的生理鹽水由腹主動脈注入腎臟沖洗,直至腎臟變白,取右腎組織,用錫箔紙包好后置入液氮罐中,冷凍保存,備用。

    1.5 檢測指標 采用ELISA法嚴格按照試劑盒說明書檢測血清BUN、Scr、IL-1β和IL-18水平;取相同腎組織,蘇木素伊紅(HE)染色后,使用光學顯微鏡觀察其病理學改變;將冷凍的腎組織制備成組織勻漿后,使用考馬斯亮藍法(Bradford)檢測蛋白質(zhì)含量,采用Western Blot法檢測腎組織勻漿NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β 和IL-18 的表達量,并檢測目標蛋白及內(nèi)參β-actin條帶的光密度比值,半定量分析其表達情況。

    1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗結(jié)果均以均值±標準差表示,使用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析。不同組間的差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA),P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 腎功能變化 從圖1可以看出,與假手術(shù)組相比,CLP組在手術(shù)后3 h血清中BUN和Scr的表達出現(xiàn)增高,6 h差異顯著(P<0.05),隨著手術(shù)后時間的延長呈現(xiàn)出逐漸遞增的趨勢,24 h達到最高值(P <0.01)。

    2.2 腎組織的病理學變化 從圖2可以看出,術(shù)后24 h假手術(shù)組大鼠的腎小球結(jié)構(gòu)基本正常;CLP組大鼠術(shù)后12 h腎小管上皮細胞腫脹,腎間質(zhì)炎癥細胞浸潤;CLP術(shù)后24 h皮髓質(zhì)交界處近端小管壞死顯著,彌漫性細胞崩解及壞死,損傷進一步加重。

    2.3 腎組織NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18的表達變化 采用Western blot法檢測了假手術(shù)組術(shù)后24 h以及CLP組術(shù)后0、6、12、18和24 h大鼠腎組織中NLRP3的表達情況。從圖3可以看出,CLP組NLRP3的表達均高于假手術(shù)組。與假手術(shù)組相比,CLP術(shù)后6 h差異顯著(P<0.05),12、18和24 h呈極顯著性差異(P<0.01),其中18 h表達量最高。

    2.4 腎組織ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18的表達變化 采用Western blot法檢測了假手術(shù)組術(shù)后24 h以及CLP組術(shù)后12 h和24 h大鼠腎組織中ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18的表達情況。從圖4可以看出,與假手術(shù)組相比,CLP術(shù)后12 h和24 h均差異極顯著(P<0.01或P<0.001)。

    2.5 血清中IL-1β和IL-18水平的變化 ELISA檢測結(jié)果表明,與假手術(shù)組相比CLP術(shù)后12 h和24 h大鼠血清IL-1β和IL-18水平均差異極顯著(IL-1β為P<0.01;IL-18為P<0.001)(圖5)。

    3 討論

    AKI是一種較常見的臨床綜合征,可發(fā)于醫(yī)院各大科室 。感染導致膿毒癥是引起AKI最重要的因素之一[2,10]。研究膿毒癥AKI過程中分子水平的變化,有利于尋找防治膿毒癥所致AKI的藥物靶點,從而降低其病死率。

    該試驗采用CLP法制備大鼠膿毒癥模型,即目前公認的與臨床相關(guān)性較強的膿毒癥模型[11]。該試驗中膿毒癥大鼠術(shù)后6 h血清BUN和Scr水平顯著高于假手術(shù)組,并且隨著時間的延長呈遞增趨勢;病理學檢測發(fā)現(xiàn),膿毒癥大鼠術(shù)后24 h腎小管上皮細胞變性,皮髓質(zhì)交界處近端小管壞死顯著,表明膿毒癥可導致AKI,并且隨著時間的延長而損傷加重。

    機體在天然的免疫系統(tǒng)的幫助下,可以快速識別外來的多種非特異性損傷,而模式識別受體則是天然免疫細胞激活的必要條件[12-13]。近年來,作為胞質(zhì)內(nèi)模式識別體的NLRP3炎癥小體與損傷的密切關(guān)系日益受到廣泛關(guān)注。NLRP3被激活后形成的NLRP3炎癥小體,可剪切活化caspase-1蛋白前體,細胞可以產(chǎn)生和釋放有生物活性的IL-1β和IL-18。IL-1β和IL-18都屬于IL-1超家族,主要由單核巨噬細胞分泌,作為機體內(nèi)重要的細胞因子,IL-1β和IL-18作用于免疫相關(guān)細胞,促使這些細胞產(chǎn)生相應的免疫效應[14]。

    研究表明,機體的多種炎癥反應(如動脈粥樣硬化、糖尿病等)都存在 NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18軸的紊亂[15-16]。該研究中CLP組大鼠腎組織NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18和血清IL-1β/IL-18水平均顯著升高,且隨著術(shù)后時間的延長而遞增,表明膿毒癥引起的AKI可能與激活NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18軸有關(guān),而抑制 NLRP3的激活可能有助于減輕膿毒癥AKI的發(fā)生和發(fā)展。該研究結(jié)果為膿毒癥AKI的防治提供試驗基礎(chǔ)。

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