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    嵌合雙串聯(lián)OVA T細胞表位的RHDV VP60蛋白免疫特性研究

    2015-03-18 12:22:14宋艷華范志宇魏后軍薛家賓徐為中
    安徽農業(yè)科學 2015年32期
    關鍵詞:表位外源特異性

    宋艷華,張 燕,胡 波,范志宇,魏后軍,劉 星,黃 兵,薛家賓,徐為中,王 芳*

    (1.江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所,農業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室,國家獸用生物制品工程技術研究中心,江蘇南京210014;

    2.山東省農業(yè)科學院家禽研究所,山東濟南250023)

    兔出血癥(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一種具有高度傳染性、高發(fā)病率、高致死性的疾病,是兔的一種毀滅性傳染?。?-2]。該病在世界各地都有發(fā)生,在歐洲和東亞地區(qū)呈地方性流行[3-5]。兔出血癥的病原RHDV是杯狀病毒的成員之一,屬于單鏈正股RNA病毒,基因組長約7.5 kb,其衣殼蛋白VP60可自行裝配形成VLPs(Virus-like particles)[6-9],是 RHDV 結構及免疫原性研究的重點[10-13]。目前,已有大量研究表明VP60 VLPs可以作為外源表位遞呈載體和基因轉移載體,為其發(fā)展成為攜帶多表位的載體疫苗提供依據[14-18]。

    為進一步擴展RHDV VLPs作為載體容納外源片段的長度以及作為載體有效遞呈外源T細胞表位的能力,筆者將外源雙串聯(lián)CD8+T細胞表位,序列為GSSIINFEKLGSSIINFEKLGS,按照以下方式分別整合到VP60序列中:將雙串聯(lián)OVA CD8+T細胞表位插入VP60 N末端;將雙串聯(lián)OVA CD8+T細胞表位序列分別替換VP60蛋白的2~13AA和302~309AA,通過桿狀病毒表達載體構建嵌合體,最終表達獲得3種嵌合蛋白,分別命名為 VP60-DN1、VP60-DN2 和 VP60-DC[19-20]。在上述研究的基礎上,筆者將獲得嵌合蛋白進行濃縮純化,選擇特異性的C57BL/6雌性小鼠進行免疫試驗,通過體液免疫應答和細胞免疫應答全面闡述VP60作為載體遞呈外源表位的能力,進一步證實VP60 VLPs具有作為疫苗載體的潛在價值。

    1 材料與方法

    1.1 試劑、病毒和實驗動物 重組桿狀病毒rAcV-Bac-VP60、rAcV-Bac-DN1、rAcV-Bac-DN2 和 rAcV-Bac-DC 由農業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室構建并保存[2,19-20]。OVA CD8+T細胞表位多肽由吉爾生化公司合成;ELISPOT試劑盒購自Mabtech公司。7~8周齡C57BL/6雌性小鼠購自揚州大學比較醫(yī)學中心。

    1.2 病毒樣顆粒的電鏡觀察 將重組桿狀病毒rAcV-Bac-VP60、rAcV-Bac-DN1、rAcV-Bac-DN2 和 rAcV-Bac-DC 接 種Sf9細胞,培養(yǎng)4~5 d待細胞完全病變后,分別收獲細胞培養(yǎng)物,3 000 r/min離心5 min,棄上清,沉淀用PBS重懸洗滌3次后,反復凍融3次,12 000 r/min離心5 min,取上清,用作電鏡觀察。將待檢病毒培養(yǎng)物樣品滴于載樣銅網上,吸附作用2 min,將2%的磷鎢酸染液滴于銅網上,固定2 min。室溫干燥后用H-7650型透射電鏡對嵌合蛋白進行觀察。

    1.3 嵌合蛋白的制備 將4種重組桿狀病毒分別以1%體積比接種于單層Sf9昆蟲細胞,培養(yǎng)4~5 d待細胞完全病變后,分別收獲細胞培養(yǎng)物,反復凍融3次后,5 000 g離心15 min去除細胞碎片,再次10 000 g離心30 min去除大的蛋白復合物和桿狀病毒粒子,上清中的VLPs再次100 000 g離心2.5 h進行濃縮,4℃PBS重懸沉淀,進一步通過蔗糖密度梯度離心進行純化,將樣品鋪于10% ~50%蔗糖上,100 000 g 4℃離心2 h,吸取分界面的樣品,再次超速離心100 000 g 4℃離心2 h除去蔗糖,沉淀用PBS重懸。利用BAC蛋白定量試劑盒測定純化后重組蛋白的濃度,最終獲得的重組蛋白分別命名為DN1、DN2、DC和VP60蛋白。

    1.4 嵌合蛋白的免疫特性研究

    1.4.1 動物免疫。將嵌合蛋白DN1、DN2、DC以及VP60蛋白分別免疫7~8周齡C57BL/6雌性小鼠,每組5只,共免3次,每次間隔2周,免疫程序見表1。設置相同注射體積的PBS組作為空白對照組。于首免后0、4和6周對所有小鼠尾部采血分離血清,采用建立的間接ELISA方法[21]檢測VP60特異性抗體滴度。于首免后6周將所有小鼠安樂死后分離脾淋巴細胞,用于檢測特異性IFN-γ分泌水平。

    表1 動物實驗免疫程序

    1.4.2 VP60特異性抗體效價的測定。首免后0、4和6周對所有小鼠尾部采血分離血清,采用間接ELISA法檢測各組小鼠血清中抗VP60的特異性抗體滴度。用pH 9.6包被液稀釋VP60蛋白,4℃下包被過夜。脫脂乳37℃下封閉2 h。洗滌后每孔加入倍比稀釋的待檢血清,100μl/孔,37℃孵育1 h。加入1∶10 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG,37℃孵育1 h。加入顯色液100μl/孔,避光作用10 min,最后加入終止液,50μl/孔。自動酶標儀測定OD450值,將P/N≥2.1即判定為陽性,計算抗體滴度。

    1.4.3 ELISPOT檢測特異性IFN-γ分泌水平。首免后6周,將各免疫組小鼠處死取脾臟,分離脾淋巴細胞,用含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋細胞濃度為2.5×106個/ml。每組小鼠的脾淋巴細胞作3個重復孔,并設置非特異性刺激物ConA為陽性對照。ELISPOT檢測步驟為:用50μl/孔70%乙醇預處理ELISPOT板;棄去液體,無菌水洗滌5次;用無菌PBS(pH 7.4)稀釋包被IFN-γ 抗體(AN18)至15 μg/ml,每孔100μl,4℃包被過夜;棄去包被液,并用無菌PBS洗板5次;加入含10%胎牛血清RPMI-1640 200μl/孔,室溫孵育30 min。棄去細胞上清,加入含有2.5μg/ml OVA T細胞表位多肽刺激物的脾淋巴細胞懸液,200μl/孔。用錫箔紙包住板子置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱,孵育48 h。48 h后棄去細胞液,PBS洗板5次;用0.5%FBS-PBS稀釋檢測抗體(R4-6A2-生物素)至1 μg/ml,100 μl/孔,室溫作用2 h。PBS 洗板5 次,用0.5%FBS –PBS1∶1 000 稀釋聯(lián)合親霉素-ALP,100 μl/孔,室溫作用1 h。PBS洗板5次,底物(BCIP/NBT-plus)用0.45μm的濾器進行過濾,100μl/孔,室溫作用直至出現(xiàn)斑點。用水沖洗即可終止顯色反應,將板子倒置晾干,室溫避光保存板子。利用ELISpot reader觀察并計數斑點。

    2 結果與分析

    2.1 嵌合蛋白的鑒定 電鏡結果表明,3種嵌合蛋白DN1、DN2和DC均可形成大小約為40 nm的VLPs,形態(tài)大小均與VP60蛋白VLPs相似(圖1),說明VP60的2~13AA和302~309AA區(qū)域的改造不影響VP60 VLPs的形成。

    2.2 VP60特異性抗體效價的測定 為檢測嵌合VP60蛋白免疫小鼠后誘導產生的體液免疫反應,分別于首免后0、4和6周采血分離血清,采用ELISA檢測各組誘導產生的特異性抗體效價滴度。從圖2可以看出,嵌合蛋白組以及VP60組誘導產生的特異性抗體效價滴度與PBS對照組差異極顯著(P<0.001)。DN1、DN2、DC 和 VP60組免疫后與免疫前抗體效價差異極顯著(P<0.001),首免后6周,嵌合蛋白組與VP60組抗體效價均高于首免后4周的水平,且消長規(guī)律一致。嵌合蛋白組與VP60組之間抗體效價并無顯著性差異(P>0.05)。這表明,重組蛋白免疫后能有高效地誘導機體產生抗VP60特異性抗體,且外源雙串聯(lián)T細胞表位的插入并未影響抗體產生的水平,嵌合蛋白有效地保持了VP60蛋白原有的免疫特性。

    2.3 ELISPOT檢測特異性IFN-γ分泌水平 為了檢測嵌合蛋白中插入的雙串聯(lián)OVA T細胞表位能否誘發(fā)特異性細胞免疫應答,首免后6周分離免疫小鼠脾淋巴細胞,利用合成OVAT細胞表位多肽刺激淋巴細胞,ELISPOT檢測各免疫組小鼠脾臟淋巴細胞分泌特異性IFN-γ的水平。從圖3可以看出,VP60組無斑點產生,而3種嵌合蛋白組均顯示出一定數量的斑點,說明能夠誘導特異性IFN-γ的分泌,同時非特異性刺激劑ConA作為陽性對照,能夠誘導產生大量的IFN-γ的分泌。

    將所有細胞孔中的斑點數據進行分析。從圖4可以看出,3種嵌合蛋白免疫小鼠脾淋巴細胞均能夠分泌特異性IFN-γ,且分泌水平顯著高于 VP60及 PBS對照組(P<0.001),其中DN1和DN2組分泌特異性IFN-γ的水平顯著高于DC組(P<0.05)。該結果表明在VP60 N端插入外源T細胞表位與VP60 302~309AA相比,能夠誘導產生的細胞免疫應答更加強烈。

    3 討論

    在昆蟲細胞中表達RHDV VP60蛋白時,它能夠自發(fā)地形成形態(tài)學上和抗原學上與天然病毒無差異的病毒樣顆粒,其可以誘導機體產生中和抗體及有效的細胞免疫應答,不含有遺傳物質,能夠攜帶和有效遞呈外源片段,可以作為疫苗載體,為新型疫苗的研制提供基礎。Nagesha等[17]研究了對RHDV VP60的N-端和C-端進行缺失處理或用藍舌病毒衣殼蛋白VP7上的一個特征性的6個氨基酸殘基位點—Btag進行替換,結果表明在N-端插入外源序列不影響嵌合蛋白形成VLPs。E.Crisci[14]等在 VP60 的 N 端和 306AA 中插入單個OVA CD8+T細胞表位,結果顯示可形成嵌合的RHDV樣的病毒粒子,且可誘導強烈的細胞免疫應答。Khairunadwa Jemon等[22]將人通用輔助性T細胞表位PADRE插入VP60蛋白的N末端,并在形成的VLPs表面連接人乳頭瘤病毒E6蛋白中一小肽,該嵌合VLPs能夠對腫瘤小鼠的產生有效的免疫治療,并延長腫瘤小鼠的存活時間,研究表明VP60 N末端是一個良好的外源T細胞表位插入位點。在以上研究報道的基礎上,筆者選擇N端插入或替換為雙串聯(lián)OVA CD8

    +T細胞表位的方式構建并獲得2種嵌合蛋白,且將302~309AA替換為串聯(lián)OVA CD8+T細胞表位構建并獲得一種嵌合蛋白,嵌合蛋白共攜帶外源片段的長度為22個氨基酸,通過嵌合蛋白的純化鑒定、動物免疫以及免疫后體液和細胞免疫應答的檢測分析,結果發(fā)現(xiàn)嵌合蛋白仍然具有形成VLPs的能力,且能夠誘導產生高水平的特異性細胞免疫應答,該試驗結果與相關報道結果一致,且進一步擴展了RHDV VP60作為載體容納外源片段的長度,驗證了VLPs具有高效遞呈外源T細胞表位的能力。

    Xue Wang等通過低溫電鏡和晶體學技術解析RHDV的結構,發(fā)現(xiàn)VP60的300~318位氨基酸含有位于病毒粒子最外表面的Loop區(qū)[13]。該研究中選取的替換位點302~309AA包含在300~318位氨基酸中,位于P2亞單位突環(huán)處,且不包含保守氨基酸位點,故可能對外源基因的耐受性較高。該研究結果表明在VP60的N端和302~309位插入長達66 bp的外源片段后不影響VP60的自我組裝。

    ELISPOT技術是一種國際公認的用于檢測特異性效應細胞分泌水平的方法。為檢測VP60作為展示系統(tǒng)遞呈外源OVA T細胞表位的能力,筆者在首免后6周分離脾淋巴細胞,利用ELISPOT方法進行檢測。結果表明,嵌合蛋白組均能誘導分泌特異性IFN-γ。該研究中VP60 N端插入外源T細胞表位的嵌合蛋白組比在VP60 302-309位插入外源表位的嵌合蛋白組引起的特異性細胞免疫應答能力更強,此結果與E.Crisci等的報道一致,進一步證實了N末端能夠更加有效的遞呈外源T細胞表位。

    筆者利用前期構建的3種嵌合蛋白DN1、DN2和DC,進行動物免疫試驗,通過體液和細胞免疫應答檢測嵌合蛋白的免疫特性,結果表明3種嵌合蛋白均能引起針對載體VP60的特異性抗體應答;且能夠誘導特異性IFN-γ的分泌,其中DN1和DN2誘導的分泌水平高于DC組。這說明在VP60 N端插入外源T細胞表位比在VP60 302~309位插入表位引起的特異性細胞免疫應答能力更強。該研究結果擴展了VP60-VLPs作為載體容納外源片段的長度,同時進一步驗證了VP60-VLPs遞呈外源表位的載體效應。

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