豇豆屬作物遠(yuǎn)緣雜交研究進展

戴希剛，郭瑞，陳禪友

（江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心，武漢，430056）

豇豆屬（Vigna）作物屬于豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papilionaceae），在我國栽培和食用歷史悠久，全世界許多國家也普遍種植。我國豇豆屬作物 主要有豇豆（V.unguiculata）、綠豆（Vigna radiate）、飯豆（V.umbellata）、小豆（V.angularis）和黑吉豆（V.mungo）等，其中栽培面積較大的主要是豇豆、綠豆和小豆[1]。目前，這些豇豆屬作物的育種還停留在傳統(tǒng)育種階段，育種進程均較緩慢。如在豇豆的育種上，國外目前的工作重點主要放在從豇豆種質(zhì)中篩選抗病蟲資源，該方法由于備選種質(zhì)遺傳多樣性低，基因庫小，因此限制了篩選范圍[2]。要在較短時間里培育出符合目標(biāo)性狀的豇豆屬新品種，需要有豐富的可供選擇的基因資源材料。豇豆屬具備豐富的野生種質(zhì)資源，其中有些資源具有抗病蟲的優(yōu)良特性[3～5]，可以直接應(yīng)用于豇豆屬抗病蟲育種工作。本文詳細(xì)介紹了國內(nèi)外豇豆屬種質(zhì)資源及豇豆屬遠(yuǎn)緣種間雜交的研究進展，為豇豆屬作物的育種工作提供參考。

1 豇豆屬遺傳資源

豇豆屬包括Ceratotropis，Haydonia，Lasiospron，Macrorhyncha，Plectotropis，Sigmoidotropis和Vigna7個亞屬[6]，其中只有Vigna,Ceratotropis和Plectotropis3個亞屬有栽培種[7]。

Vigna亞屬有毛豇豆、長葉豇豆、狹葉豇豆、卷毛豇豆、濱豇豆、野豇豆、烏頭葉豇豆、細(xì)莖豇豆、琉球豇豆、黑種豇豆、三裂葉豇豆等。Ceratotropis亞屬由于主要分布在亞洲，也被稱為亞洲豇豆亞屬，主要栽培種有綠豆、飯豆、小豆、黑吉豆、烏頭葉菜豆等[4]。

2 遠(yuǎn)緣雜交的意義

遠(yuǎn)緣雜交可以打破種屬間的生殖隔離，將兩個或多個物種經(jīng)過長期進化積累起來的有益特性重新組合，以形成具備抗病、抗蟲、抗逆性強、優(yōu)質(zhì)等性狀的新類型和新品種。因此，遠(yuǎn)緣雜交育種在創(chuàng)造植物新性狀、新類型、新品種方面有重大意義。通過研究這些新品種，不僅可以了解物種的進化史，明晰物種間的親緣關(guān)系，建立分類系統(tǒng)，而且還能指導(dǎo)人工控制新品種形成，更有利于獲得具有良好綜合性狀的新種。同時，利用遠(yuǎn)緣雜交創(chuàng)造的雜交后代群體，結(jié)合品種間的雜交后代群體，可以構(gòu)建相應(yīng)種群的遺傳圖譜[8，9]，并進行基因和基因組作圖。因此，遠(yuǎn)緣雜交在物種的起源、進化、發(fā)育、引種、遺傳等生物學(xué)問題的研究上，也具有重要的理論意義。近幾十年來，遠(yuǎn)緣雜交已被廣泛應(yīng)用于作物育種中，并創(chuàng)造了一些優(yōu)良品種[10～13]。

3 豇豆屬遠(yuǎn)緣雜交

3.1 遠(yuǎn)緣雜交的親和性

遠(yuǎn)緣雜交親和性如何，雜種能否正常發(fā)育，雜種是否可育以及能否去除不利性狀的連鎖，這些都是育種者最關(guān)心的問題，也正是它們限制了遠(yuǎn)緣雜交在作物育種中的應(yīng)用[14]。豇豆屬種間雜交的研究表明，在不同亞屬間不能獲得可存活的雜交后代[15]，Barone等[16]的研究表明，豇豆種和其近緣種之間存在較大的生殖障礙，而豇豆種亞種間的生殖障礙卻較低[17，18]。Chen 等[19]對綠豆（V.radiata）、黑吉豆（V.mungo）、飯豆（V.umbelluta）和小豆（V.angularis）四種豇豆屬作物進行了遠(yuǎn)緣雜交研究，在綠豆×黑吉豆、綠豆×飯豆和黑吉豆×小豆的種間雜交上獲得了可育種子。另外發(fā)現(xiàn)，利用種內(nèi)雜種作親本要比利用栽培品種作親本進行種間遠(yuǎn)緣雜交的效果好，在綠豆與飯豆的雜交上，利用種內(nèi)雜種作親本進行遠(yuǎn)緣雜交大大提高了結(jié)實率；正反交的結(jié)莢率差異達(dá)到了極顯著水平。雙親的基因型不僅影響種間雜種苗的生長，同時也影響其育性。綠豆×飯豆、綠豆×小豆和黑吉豆×小豆的種間雜種完全不育，而綠豆×黑吉豆、飯豆×小豆和小豆×飯豆的種間雜種育性明顯減弱。

3.2 幼胚培養(yǎng)

豇豆屬作物的遠(yuǎn)緣雜交失敗的原因通常有兩個[19，20]，一個是由于花粉管不能正常穿過花柱、柱頭，另一個是由于受精后胚敗育，后者是常見原因。Barone等[16]也得到了相似結(jié)論，他們在野豇豆（V.vexillata）與豇豆（V.unguiculata）的種間雜交研究中正反交均未能獲得雜交種子，研究表明存在兩個不同的雜交生殖障礙：受精前生殖隔離和受精后生殖隔離。如果我們從授粉后的幼莢中剝離出幼胚，然后進行組織培養(yǎng)，就有可能打破這種障礙從而獲得雜種植株[8，21]，因此，幼胚培養(yǎng)可以為遠(yuǎn)緣雜交獲得雜種后代提供技術(shù)支撐。

Chen等[19]通過胚培養(yǎng)獲得了綠豆×小豆、飯豆×小豆和小豆×飯豆的雜種植株。Chen等[22]通過將幼胚培養(yǎng)獲得的胚性愈傷組織再生獲得了綠豆 （2n=22）與四倍體V.glabrescens（2n=44）的種間正反交雜種植株，該雜種經(jīng)自交后幾乎不育，但是與二倍體親本回交后可以正常結(jié)實，能獲得大量的自交種子。Fatokun等[23]通過胚拯救技術(shù)獲得了豇豆與多毛野生近緣種V.pubescens的種間雜種，F(xiàn)1表現(xiàn)出植株生長健壯、部分不育、稍微有毛、及其他兩親本的中間特性。

3.3 胚培養(yǎng)方法

Gomathinayagam 等[24]對野豇豆（V.vexillata）與豇豆（V.unguiculata）進行了種間雜交研究。播種時每隔兩周重復(fù)播種3次，以使花期相遇。授粉采取正反交，授粉10～12 d后收集豆莢，消毒后利用體視顯微鏡剝離心形期幼胚，將野豇豆×豇豆的幼胚接種到MS+2 mg/L 2，4-D培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得了胚性愈傷組織。將愈傷組織接種到MS+2 mg/L BAP（6-芐氨基嘌呤）+40 mg/L腺嘌呤硫酸鹽+500 mg/L CH（水解酪蛋白）+10%豇豆嫩莢浸提液（100 g嫩莢加入250 mL水?dāng)嚢韬? 000 r/min離心5 min）的培養(yǎng)基上獲得了13個再生植株。雜種植株表現(xiàn)出雙親的中間形態(tài)特征，并遺傳了野豇豆的莖葉莢多毛的特性，從而可以抵抗病原的侵害。Tyagi等[25]利用離體培養(yǎng)技術(shù)也成功獲得了綠豆和豇豆的雜交種，他們將豆莢用赤霉酸持續(xù)處理9～10 d，然后再進行胚培養(yǎng)，約10%的胚胎培養(yǎng)成苗。

3.4 胚培養(yǎng)時間

Gosal等[26]通過幼胚培養(yǎng)獲得了黑吉豆（V.mungo）與綠豆（V.radiata）的種間雜種，分離授粉后 11～17 d的幼胚，接種于MS+IAA+KT（呋喃腺嘌呤）+CH（或椰子汁）可形成正常植株，小于11 d的幼胚會形成愈傷組織或白化、細(xì)長、柔弱的植株。Siriwardhane等[20]的研究認(rèn)為，豇豆屬作物之間的遺傳差異往往導(dǎo)致不同種間雜交時幼胚敗育，他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)幼莢長到10 d左右幼胚便出現(xiàn)敗育，因此，要想得到雜交后代植株，只有在種子敗育前進行幼胚培養(yǎng)。Barone等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，豇豆與野豇豆種間雜交后，花粉管發(fā)育異常導(dǎo)致受精率減少，僅有18%～30%受精，雜交胚發(fā)育過程中胚和胚乳核總是在授粉后5～8 d敗育，胚在發(fā)育到球形階段就停止生長，而處于此早期階段的胚還不能剝離幼胚進行胚拯救。

3.5 橋梁親本的利用

對于那些遠(yuǎn)緣雜交親和性較差的豇豆屬作物，可以利用親緣關(guān)系與兩親本較近的第三個種作為橋梁，起到性媒介的作用。研究表明，橋梁作物可以克服遠(yuǎn)緣雜交的不親和性。Siriwardhane等[20]證實小豆近緣野生種V.riukiuensis均可和飯豆、小豆雜交獲得可育雜種，因此，V.riukiuensis可作為橋梁作物將飯豆中的某些抗蟲基因轉(zhuǎn)到小豆中去。Tomooka等[4]的研究也證實小豆近緣野生種V.minima、V.nakashimae也可作為飯豆和小豆間的橋梁作物，從而擴大了橋梁作物的選擇范圍。日本育種學(xué)者Peerasak等[27]已經(jīng)利用橋梁親本，將抗豆象基因從飯豆轉(zhuǎn)移到了小豆中，創(chuàng)新了小豆種質(zhì)資源。Gupta等[28]以綠豆與黑吉豆遠(yuǎn)緣雜交種作為橋梁與小豆進行了雜交試驗，獲得了1?？捎碾s交種，這說明應(yīng)用橋梁親本可以將小豆高產(chǎn)、抗病等優(yōu)良性狀轉(zhuǎn)移到黑吉豆、綠豆中去，也可以將綠豆、黑吉豆、小豆3種作物的優(yōu)良性狀集中到一種基因型中，拓寬種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)。

4 豇豆屬遠(yuǎn)緣雜交的應(yīng)用

Fujii等[3]在進行豇豆屬食用豆類抗豆象研究時發(fā)現(xiàn)了一份抗豆象的野生綠豆 （V.radiatavar.sublobata）資源——TC1966，這對于豇豆屬抗豆象育種研究具有非常重要的作用，之后研究者們針對這份抗豆象種質(zhì)展開了一系列的相關(guān)研究[29～32]。20世紀(jì)90年代，泰國科學(xué)家通過遠(yuǎn)緣雜交成功地將野生綠豆資源的抗豆象基因轉(zhuǎn)育到了栽培綠豆資源中，創(chuàng)造了具備突出抗豆象特性的優(yōu)異綠豆資源[33]；中國科學(xué)家利用上述材料進而創(chuàng)新出農(nóng)藝性狀和抗豆象性均突出的優(yōu)異資源。1994年，楊人俊等[34]將野生小豆與栽培小豆進行正反雜交試驗，結(jié)果都獲得了雜交后代。Peerasak等[27]利用遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)成功地將抗豆象基因從飯豆轉(zhuǎn)移到了小豆中，育成了性狀優(yōu)良的抗豆象小豆資源，抗性程度達(dá)100%。Kaga等[8]通過小豆與飯豆遠(yuǎn)緣雜交，通過幼胚培養(yǎng)獲得了雜種后代，利用F2群體構(gòu)建了一張包括14個連鎖群的小豆-飯豆遺傳連鎖圖譜，為小豆的基因挖掘，QTL定位等奠定了基礎(chǔ)。趙鳳梧等[35]曾嘗試將棉花與豇豆進行遠(yuǎn)緣雜交，試圖將豇豆的優(yōu)異基因（如豇豆胰蛋白酶抑制劑基因）導(dǎo)入棉花中，開啟了利用科間遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)轉(zhuǎn)移豇豆屬作物優(yōu)異基因的試探。

5 小結(jié)

中國是綠豆和小豆的起源地之一，全國多地都有綠豆、小豆的野生種及近緣野生種的分布，其中很多野生資源具有抗蟲、抗病等優(yōu)良性狀[1]。飯豆在我國也廣為分布，能在炎熱和潮濕的貧瘠土壤中生存，具有產(chǎn)量高[36]、抗豆象[37，38]、抗黃花葉病毒病[39]和細(xì)菌性葉斑病[40]等優(yōu)良性狀。近年來，豇豆病蟲害問題日益嚴(yán)重，豇豆栽培農(nóng)藥殘留事件屢見不鮮，因此，尋找抗病蟲豇豆資源，培育抗病蟲豇豆品種成為豇豆育種的新興課題。利用豇豆與綠豆、小豆、飯豆種間雜交將綠豆、小豆、飯豆的抗病蟲害基因?qū)媵怪?，從而?chuàng)新豇豆種質(zhì)顯得前景廣闊。

對于豇豆屬作物研究者來說，應(yīng)大量收集豇豆屬栽培及野生種質(zhì)資源，并對其各項農(nóng)藝性狀進行鑒定、評價，篩選出優(yōu)異資源，用以開展豇豆屬遠(yuǎn)緣雜交育種研究，或利用作圖群體構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，開展豇豆屬近緣種的比較基因組學(xué)研究，同時對重要農(nóng)藝性狀進行基因定位，挖掘優(yōu)異變種，為開展分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。

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