鈣黏附蛋白E和類賴氨酰氧化酶2在膽管癌中的表達(dá)及其相關(guān)性研究

王建華

(湖南省常德市第四人民醫(yī)院消化內(nèi)科 415000)

?

·論 著·

鈣黏附蛋白E和類賴氨酰氧化酶2在膽管癌中的表達(dá)及其相關(guān)性研究

王建華

(湖南省常德市第四人民醫(yī)院消化內(nèi)科 415000)

目的 探討類賴氨酰氧化酶2(LOXL2)和鈣黏附蛋白E(E-cadherin)在膽管癌中的表達(dá)，并分析兩者表達(dá)水平的相互關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)(SP)法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測膽管癌組織中E-cadherin和LOXL2 的表達(dá)情況。結(jié)果 E-cadherin 在膽管癌組的表達(dá)明顯低于癌旁組織組和正常膽管組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；LOXL2 在膽管癌組的表達(dá)明顯高于癌旁組織組和正常膽管組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。E-cadherin和LOXL2 在膽管癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論 E-cadherin 的表達(dá)減弱和LOXL2 的表達(dá)增高共同參與膽管癌的發(fā)生和發(fā)展。

鈣黏附蛋白E； 類賴氨酰氧化酶2； 膽管癌； 浸潤和轉(zhuǎn)移； 免疫組織化學(xué)方法； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

膽管癌是發(fā)生于肝內(nèi)或肝外膽管上皮的惡性腫瘤，惡性程度高。影響膽管癌患者治療和遠(yuǎn)期生存率的主要因素是腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)(SP)法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測膽管癌中鈣黏附蛋白E(E-cadherin)和類賴氨酰氧化酶2(LOXL2)基因的表達(dá)水平，并分析兩者的相關(guān)性，對探討膽管癌浸潤、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有重要的意義。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 該院2011年1月至2013年12月外科手術(shù)治療的47例膽管癌患者的癌組織標(biāo)本(膽管癌組)；47例膽管癌癌旁組織標(biāo)本(距癌組織≥1 cm)(癌旁組織組)。所有患者術(shù)前均未接受過放療和化療，標(biāo)本均經(jīng)病理檢查證實(shí)。取同期就診于該院的良性膽管疾病患者的正常膽管標(biāo)本20例(正常膽管組)。

1.2 檢測方法 應(yīng)用SP法和RT-PCR技術(shù)檢測E-cadherin和LOXL2在所有標(biāo)本組織中的表達(dá)水平。

1.3 儀器與試劑 YAQUANG生物組織脫水機(jī)，TB-718生理組織包埋機(jī)，AS325轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)，電子恒溫水浴箱，光學(xué)顯微鏡，旋渦振蕩器，干式恒溫器K10CD，勻漿機(jī)，低溫冷凍離心機(jī)，Real-Time檢測儀ABI-7500。SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒，DAB顯色試劑盒，LOXL2鼠抗人單克隆抗體，SYBRGreen PCR試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)資料進(jìn)行分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計量資料使用wilcoxon秩和檢驗(yàn)，相關(guān)分析應(yīng)用Spearman等級相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SP法檢測3組患者E-cadherin和LOXL2的結(jié)果比較 見圖1和表1。

2.2 RT-PCR檢測3組患者E-cadherin和LOXL2 結(jié)果比較 見圖2和表2。

表1 3組患者E-cadherin和LOXL2表達(dá)水平結(jié)果比較[n(%)]

注：A、B、C分別為膽管癌、癌旁組織、正常膽管中E-cadherin蛋白的表達(dá)；D、E、F分別為膽管癌、癌旁組織、正常膽管中LOXL2蛋白的表達(dá)。

圖1 3組患者E-cadherin和LOXL2蛋白的表達(dá)

2.3 膽管癌組織中E-cadherin 和LOXL2 表達(dá)的相關(guān)性 膽管癌組織中E-cadherin 和LOXL2 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。見表3。

表3 膽管癌中E-cadherin和LOXL2蛋白表達(dá)的相互關(guān)系(n)

注：A、C、E分別為膽管癌組中β-actin mRNA、E-cadherin mRNA、LOXL2 mRNA熒光定量擴(kuò)增曲線；B、D、F分別為膽管癌組織中β-actin mRNA、E-cadherin mRNA、LOXL2 mRNA熒光定量融解曲線。

圖2 3組患者E-cadherin和LOXL2 mRNA的表達(dá)

3 討 論

腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移是多基因參與、多步驟完成的復(fù)雜過程，其中腫瘤細(xì)胞黏附、運(yùn)動能力的改變，與細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用是腫瘤發(fā)生浸潤、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，也是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。

3.1 E-cadherin在膽管癌中的表達(dá)及其與臨床參數(shù)的關(guān)系 Chen等[2]用實(shí)驗(yàn)證實(shí)了E-cadherin可以限制L細(xì)胞侵襲。Peina-Slaus等[3]應(yīng)用SP法檢測了60例人腦膜瘤中E-cadherin的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)70%的腦膜瘤樣本中E-cadherin表達(dá)下調(diào)，提示E-cadherin的不穩(wěn)定性在腦膜瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。Zhang 等[4]應(yīng)用Western印跡和RT-PCR技術(shù)檢測了膽管癌細(xì)胞株QBC939和FRH 0201，結(jié)果表明snail的激活和E-cadherin的抑制可能依賴人核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的激活，NF-κB促進(jìn)snail上調(diào)，從而抑制E-cadherin表達(dá)，最終促進(jìn)膽管癌的浸潤、轉(zhuǎn)移。本研究采用RT-PCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示，E-cadherin 的表達(dá)在膽管癌組、癌旁組織組、正常膽管組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。本組結(jié)果表明，膽管癌患者E-cadherin 表達(dá)減弱，與相關(guān)報道一致。E-cadherin的表達(dá)減弱與膽管癌的浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其機(jī)制可能是E-cadherin減少或缺失，導(dǎo)致細(xì)胞間的黏附減弱，原有的細(xì)胞外基質(zhì)降解、形成新的細(xì)胞-基質(zhì)黏附，細(xì)胞運(yùn)動能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移。

3.2 LOXL2在膽管癌中的表達(dá)及其與臨床參數(shù)的關(guān)系 Peinado等[5]研究報道LOXL2的高表達(dá)與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，甚至在MDCK上皮細(xì)胞系中LOXL2過度表達(dá)可誘導(dǎo)完整的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)過程，伴隨著上皮標(biāo)志物的丟失和間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)增加。Li等[6]研究發(fā)現(xiàn)，CC細(xì)胞株QBC939中HCVc可誘導(dǎo)EMT，其可能的機(jī)制是通過LOXL2的途徑。Peng等[7]對胃癌組織表達(dá)相關(guān)分析顯示，LOXL2通過Src/FAK通路而不是snail/E-cadherin通路促進(jìn)侵襲。本研究應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測LOXL2 的表達(dá)在膽管癌組、癌旁組織組、正常膽管組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示膽管癌患者LOXL2 的表達(dá)增強(qiáng)，與其他研究一致。LOXL2的表達(dá)增強(qiáng)與膽管癌的浸潤、轉(zhuǎn)移相關(guān)，其機(jī)制可能是LOXL2的表達(dá)增強(qiáng)，通過缺氧調(diào)節(jié)作用，參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)ECM重構(gòu)等作用導(dǎo)致腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移。

3.3 E-cadherin和LOXL2在膽管癌浸潤轉(zhuǎn)移中的相互關(guān)系 本研究在膽管癌組織中對E-cadherin和LOXL2的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.464，P=0.001)。Peinado等[5]研究表明，賴氨酰氧化酶基因家族的2個成員LOXL2和LOXL3與snail相互影響，相互協(xié)同下調(diào)E-cadherin的表達(dá)。Schietke等[8]的研究也表明，LOXL2是HIF-1的一個直接靶基因，賴氨酰氧化酶的激活能抑制E-cadherin蛋白的表達(dá)，并且可導(dǎo)致缺氧從而抑制E-cadherin蛋白的表達(dá)，最終影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)化且促進(jìn)細(xì)胞的浸潤。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Peinado等的研究結(jié)果一致，E-cadherin的表達(dá)減弱和LOXL2的表達(dá)增高共同參與了膽管癌浸潤、轉(zhuǎn)移的發(fā)生和發(fā)展。E-cadherin和LOXL2的相關(guān)性機(jī)制可能是LOXL2導(dǎo)致缺氧從而抑制E-cadherin蛋白的表達(dá)；另外，LOXL2表達(dá)增高參與snail介導(dǎo)的E-cadherin沉默，導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)減弱或缺失，致使細(xì)胞間的黏附減弱，原有的細(xì)胞外基質(zhì)降解、形成新的細(xì)胞-基質(zhì)黏附，細(xì)胞運(yùn)動能力增強(qiáng)，同時LOXL2增高可直接誘導(dǎo)EMT形成，從而提高膽管癌細(xì)胞向他處浸潤轉(zhuǎn)移的能力，最終促進(jìn)膽管癌的浸潤、轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究結(jié)果表明膽管癌組織中E-cadherin的表達(dá)減弱，LOXL2的表達(dá)增強(qiáng)，兩者在膽管癌浸潤、轉(zhuǎn)移中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，E-cadherin表達(dá)減弱和LOXL2表達(dá)增強(qiáng)與膽管癌的分化程度低、腫瘤分期高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織器官轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，主要機(jī)制可能是兩者相互作用導(dǎo)致膽管癌細(xì)胞間的黏附功能減弱或喪失，EMT形成，從而促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移。研究膽管癌中兩者的表達(dá)及其相互關(guān)系對進(jìn)一步了解膽管癌浸潤轉(zhuǎn)移的機(jī)制及評估預(yù)后具有重要的臨床意義。

[1]Zheng XH,Wang SG.Advance in the study of invasion and metastasis of cholangiocarcinoma[J].Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,2007,15(3):276-281.

[2]Chen WC，Obrink C.Cell-cell contacts mediated by E-cadherin restrict invasive behavior of L-cells[J].J Cell Biol,1991,114 (2):319-322.

[3]Peina-Slaus N,Nikuseva Marti T,Deak AJ,et al.Genetic and protein changes of E-cadherin in meningiomas[J].J Cancer Res Clin Oncol,2012,136(5):695-702.

[4]Zhang K,Zhaos J,Liu X,et al.Activation of NF-κB up-regulates snail and consequent repression of E-cadherin in cholangiocarcinoma cell invasion[J].Hepatogastroenterology,2011,58(105):1-7.

[5]Peinado H,Cruz M,Olmeda D,et al.A molecular role for lysyl oxidase-like 2 enzyme in snail regulation and tumor progression[J].EMBO J,2010,24(11):3446-3458.

[6]Li T,Li D,Cheng L,et al.Epithelial-mesenchymal transition induced by hepatitis C virus core protein in cholangiocarcinoma[J].Ann Surg Oncol,2010,17(6):1937-1944.

[7]Peng L,Ran YL,Hu H,et al.Secreted LOXL2 is a novel therapeutic target that promotes gastric cancer metastasis via the Src/FAK pathway[J].Carcinogenesis,2012,30(24):1660-1669.

[8]Schietke R,Warnecke C,Wacker I,et al.The lysyl oxidases LOX and LOXL2 are necessary and sufficient to repress E-cadherin in hypoxia:insights into cellular transformation processes mediated by HIF-1[J].J Biol Chem,2011，285(9):6658-6669.

The effect and relationship of E-cadherin and lysyl oxidase-like 2 in the invasion and metastasis of cholangiocarcinoma

WANGJian-hua

(DepartmentofGastroenterology,TheFourthPeopl'sHospitalofChangdeCity,Hunan,415000,China)

Objective To explore the expression of E-cadherin and LOXL2 in cholangiocarcinoma,and analyzed their relationship between the two factors in cholangiocarcinoma.Methods SP and RT-PCR were used to detect E-cadherin and LOXL2 in cholangiocarcinoma.Results The expression of E-cadherin was significantly lower in cholangiocar-cinoma than that in adjacent cholangiocarcinoma and normal bile duct.The expression of LOXL2 was significantly higher in cholangiocarcinoma than that in adjacent cholangiocarcinoma and normal bile duct.The expression of E-cadherin was negatively related to that of LOXL2.Conclusion Both the down-regulation of E-cadherin and the up-regulation of LOXL2 were related to the occurrence and development of cholangiocarcinoma.

E-cadherin； LOXL2； cholangiocarcinoma； invasion and metastasis； SP； RT-PCR

王建華，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.12.033

A

1672-9455(2015)12-1742-03

2014-12-15

2015-02-05)