基于近紅外光譜的天然牧草CNCPS組分分析與預(yù)測

杜雪燕， 王 迅， 柴沙駝， 劉書杰

(1.青海大學(xué)/青海省高原放牧家畜營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點實驗室/青海高原牦牛研究中心，青海 西寧 810016)

天然牧草營養(yǎng)直接影響放牧家畜的營養(yǎng)狀況、生命活動和生產(chǎn)性能。準確獲取天然牧草營養(yǎng)信息，對草地畜牧業(yè)生產(chǎn)非常重要?？的螤杻舻鞍踪|(zhì)和碳水化合物體系(CNCPS)可以將牧草的化學(xué)分析與植物細胞成分及反芻動物的消化吸收高度結(jié)合，全面深度評價天然牧草的營養(yǎng)價值。在國內(nèi)，CNCPS已廣泛應(yīng)用于反芻動物常用飼料營養(yǎng)價值測定和評價［1-3］，并且建立了適合中國肉牛和奶牛的常用飼料組分數(shù)據(jù)庫［4］，為CNCPS模型的準確預(yù)測提供基礎(chǔ)。在天然牧草營養(yǎng)評價方面，艷城等［5］測定了內(nèi)蒙古荒漠草原區(qū)8種牧草的CNCPS組分，表明CNCPS體系將飼料化學(xué)分析與反芻動物瘤胃消化利用情況結(jié)合在一起，使結(jié)果呈現(xiàn)動態(tài)指標。目前，天然牧草營養(yǎng)價值評價主要依靠傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法，檢測周期長、成本高。運用高效檢測技術(shù)準確、全面、快速測定天然牧草營養(yǎng)價值，有利于實時估測草地營養(yǎng)狀況。

近紅外光譜技術(shù)(NIRS)是現(xiàn)代光譜分析技術(shù)、計算機技術(shù)和現(xiàn)代化學(xué)計量學(xué)的高度集合體，是新興光譜分析技術(shù)［6］，以快速、實時、無損測定的優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于牧草、煙草、茶葉等產(chǎn)品的營養(yǎng)成分分析［7-9］。陳龍等［10］對 NIRS 在 CNCPS 體系中的應(yīng)用進行了積極探索，結(jié)果表明NIRS技術(shù)可以準確預(yù)測燕麥干草CNCPS蛋白質(zhì)組分含量，為NIRS在天然牧草價值方面的應(yīng)用提供了新的思路。

本試驗探討利用近紅外技術(shù)測定天然牧草中CNCPS蛋白質(zhì)組分和碳水化合物組分的可行性，為青海地區(qū)天然牧草營養(yǎng)價值數(shù)據(jù)庫的建立提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗地位于青海省河南縣，是典型的高寒草甸類高 山 嵩 草 草 地。經(jīng) 度 101°38'08.7″～101°38'13.8″，緯度 34°51'03.4″～34°51'18.1″，平均海拔3 570 m。該草地以高山嵩草(Kobresia pygmea)為主要優(yōu)勢種，次優(yōu)勢種有線葉嵩草(Kobresia capillifolia)、矮嵩草(Kobresia humilis)、雙柱頭藨草(Scripus triqueter)、異針茅(Stipa aliena)、草地早熟禾(Poa crymophila)、垂穗披堿草(Elymus nutans)等，伴生有菊科、豆科、薔薇科等牧草，主要有毒植物為秦艽(Gentiana macrophylla Pall)、橐吾(Ligularia sibirica L.)、黃花棘豆(Oxytropis ochrocephala)等。

在牧草生長季節(jié)，按照任繼周樣地設(shè)置原則［11］，采集 1.0 ×1.0 m2樣方牧草，齊地面刈割，挑出石子、毒雜草等不可食部分，將可食牧草自然風(fēng)干，共計66份樣品。所有樣品粉碎，65℃烘48 h，過篩(1 mm)，裝入自封袋，常溫避光保存，用于化學(xué)成分測定和光譜掃描。

1.2 儀器及參數(shù)

本試驗使用FOSS公司生產(chǎn)的DS2500近紅外光譜分析儀。工作參數(shù):波長400～2 500 nm;雙檢測器系統(tǒng)，硅檢測器 (400～1 100 nm)，硫化鉛檢測器(1 100～2 500 nm);數(shù)據(jù)采集頻率為1 s掃描2次;光譜分辨率:0.5 nm;波長準確度＜0.05 nm;定標軟件為WinISIⅢ;數(shù)據(jù)采集形式為lg(1/R)。工作條件:室溫25℃穩(wěn)定。

每次開機掃描光譜前，儀器預(yù)熱30 min。將處理好的樣品裝入樣品杯，大約為杯容量的3/4，每個樣品重復(fù)掃描6次，每次均掃描背景，將平均光譜保存為樣品的最終光譜，從而消除由裝樣緊實度以及樣品粒度不同所造成的誤差。

1.3 牧草營養(yǎng)指標的測定

1.3.1 CNCPS組分的定義和劃分 CNCPS體系以反芻動物瘤胃消化特征為基礎(chǔ)，將牧草化學(xué)成分、植物細胞組成、瘤胃消化利用情況有機結(jié)合，從蛋白質(zhì)組分和碳水化合物組分更深層次評價天然牧草營養(yǎng)價值。CNCPS體系將蛋白質(zhì)分為3部分:非蛋白質(zhì)氮、真蛋白質(zhì)、不可降解粗蛋白質(zhì)，分別用PA、PB、PC表示。PA在瘤胃中快速降解。真蛋白質(zhì)PB，包括 PB1、PB2、PB3，PB1是可溶于緩沖液的真蛋白質(zhì)，屬于快速降解蛋白質(zhì);PB2是中性洗滌可溶蛋白質(zhì)，屬于中速降解蛋白質(zhì);PB3是酸性洗滌可溶蛋白質(zhì)，屬于緩慢降解蛋白質(zhì)。PC是酸性洗滌不溶蛋白質(zhì)，為結(jié)合蛋白質(zhì)，是與木質(zhì)素、單寧等結(jié)合的蛋白質(zhì)。碳水化合物被分為4部分:以糖類為主的快速降解部分(CA);以淀粉和果膠為主的中速降解部分(CB1);以可利用纖維為主的慢速降解部分(CB2);以牧草細胞壁為主的不可利用纖維(CC)。

1.3.2 指標測定方法 粗蛋白質(zhì)(CP)、可溶性蛋白質(zhì) (SP)含量按AOAC方法［12］測定，酸性洗滌纖維(ADF)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)含量采用Vansoest等［13］的方法測定，每份樣品測定2個平行，取平均值。按照Sniffen等［14］的方法計算總碳水化合物(CHO)、非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(CNSC)、CNCPS 蛋白質(zhì)組分(PA、PB1、PB2、PB3、PC)、CNCPS 碳水化合物組分(CA、CB1、CB2、CC)含量。

1.4 模型的建立與優(yōu)化

樣品按3∶1比例隨機分為定標集(Calibration)和驗證集(Validation)［15］。用 WinISIⅢ軟件，采用修正偏最小二乘法(MPLS)，結(jié)合散射光譜預(yù)處理和導(dǎo)數(shù)、平滑數(shù)學(xué)預(yù)處理方法，用定標集樣品建立模型。用馬氏距離(Mahalanobis distance)和絕對偏差(Residual)分別對光譜值和化學(xué)值進行檢驗［16］，提高模型的準確度。同時進行交叉驗證，防止模型過擬合現(xiàn)象。根據(jù)定標標準偏差(SEC)、交叉檢驗標準誤差(SECV)、交叉驗證決定系數(shù)(1-VR)、預(yù)測標準誤差(SEP)等指標評價，確定最優(yōu)模型［17］。用驗證集樣品對最優(yōu)模型進行外部驗證，評價其外部預(yù)測能力［18］。用交叉驗證相對分析誤差RPDCV(SD/SECV)和外部驗證相對分析誤差RPDP(SD/SEP)對模型進行進一步評價:RPDCV和RPDP大于3，說明定標效果良好，建立的模型可以用于實際檢測;小于2.5，說明該模型難以用于實際測定;大于2.5且小于3.0，模型的預(yù)測精度有待進一步提高［19］，精度提高后模型可用于實際測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 牧草營養(yǎng)成分測定結(jié)果

根據(jù)馬氏距離檢測結(jié)果，剔除異常樣品。由常規(guī)化學(xué)分析方法和CNCPS體系蛋白質(zhì)各組分計算公式，計算天然牧草各蛋白質(zhì)組分含量。結(jié)果(表1)顯示:定標集和驗證集蛋白質(zhì)各組分含量范圍、平均值和標準差都比較接近，驗證集樣品的代表性較強;牧草中CNCPS體系蛋白質(zhì)組分含量由高到低依 次 為 PB2、PA、PB3、PC、PB1，PB2含 量 最 高(36.68%)，PB1含量最低(10.07%)。

表1 天然牧草中各蛋白質(zhì)組分含量Table 1 The contents of protein components in natural pasture

根據(jù)常規(guī)化學(xué)分析方法和CNCPS體系碳水化合物各組分計算公式，計算天然牧草各碳水化合物組分含量。結(jié)果(表2)顯示，牧草中CNCPS體系碳水化合物組分含量由高到低依次為CB2、CC、CA、CB1。CB2含量最高，達到36.37%，CB1含量最低，為1.81%。

表2 天然牧草中碳水化合物各組分含量Table 2 The contents of carbohydrates components in natural pasture

2.2 牧草樣品光譜測定結(jié)果

圖1顯示:牧草樣品光譜響應(yīng)曲線形態(tài)變化呈現(xiàn)2種趨勢。生長期牧草中含有大量的葉綠素，因葉綠素的強吸收，在以450 nm為中心的藍波段(a)和670 nm為中心的紅波段(b)出現(xiàn)吸收峰;隨牧草生長發(fā)育停止，葉綠素含量降低，葉綠素在藍、紅波段的吸收減少，反射增加;牧草干枯時，葉綠素更少，葉黃素和葉紅素在牧草葉片光譜響應(yīng)中起主導(dǎo)作用。760～900 nm是近紅外波段，是植物的高反射區(qū)，其光譜特征主要受牧草細胞結(jié)構(gòu)影響。不同牧草的色素含量、細胞結(jié)構(gòu)、含水量(自由水)均不同，因此在同一波長處，光譜響應(yīng)會有一定的變化范圍?？傊?，天然牧草樣品光譜在全波長范圍內(nèi)存在多個吸收峰，為其營養(yǎng)成分的定量分析提供了豐富的信息。

2.3 天然牧草CNCPS組分近紅外光譜分析模型的建立與評價

通過WinISIⅢ定標軟件，用修正偏最小二乘法(MPLS)及不同光譜和數(shù)學(xué)處理方法，對定標集樣品建立模型，篩選最佳模型。最佳處理參數(shù)下，模型的交叉檢驗標準誤差(SECV)最小、交叉驗證決定系數(shù)(1-VR)最大。

圖1 牧草樣品近紅外光譜圖Fig.1 NIRSspectra of natural pasture

利用最佳的光譜和化學(xué)處理方法，建立最優(yōu)模型。由表3可以看出，粗蛋白質(zhì)(CP)的交叉驗證標準誤差(SECV)為0.439 3，交叉驗證決定系數(shù)(1-VR)為0.989，交叉驗證相對分析誤差(RPDCV)為9.336;不溶蛋白質(zhì)(PC)的 SECV為2.255，1-VR為0.870，RPDCV為2.913。其他蛋白質(zhì)組分的1-VR均小于0.8。

由表4可以看出，碳水化合物組分NDF、ADF、CHO、CNSC 的 1-VR 分別為 0.975、0.932、0.964、0.966，RPDCV 分別為 6.353、3.758、5.306、5.521;CA 的1-VR 為0.846，RPDCV 為2.603;CB1、CB2、CC的1-VR 分別為 0.684、0.716、0.619，均小于 0.9，RPDCV 分別為1.870、1.940、1.786，均小于 2.5。

表3 蛋白質(zhì)組分各指標NIRS模型參數(shù)Table 3 The parameters of protein components of NIRS models

各蛋白質(zhì)組分見表1注。SNV+Detrend:標準正?；?去散射處理;1，4，4，1:一階導(dǎo)數(shù)處理，數(shù)據(jù)間隔點為4，平滑處理間隔點為4，二次平滑處理間隔點為1;2，4，4，1:二階導(dǎo)數(shù)處理，數(shù)據(jù)間隔點為4，平滑處理間隔點為4，二次平滑處理間隔點為1;None:無散射處理。SEC:定標標準偏差;SECV:交叉驗證標準誤差;1-VR:交叉驗證決定系數(shù);RPDCV:交叉驗證相對分析誤差(RPDCV=SD/SECV)。

表4 碳水化合物組分各指標NIRS模型參數(shù)Table 4 The parameters of carbohydrates components of NIRS models

各碳水化合物組分見表2注。最佳處理參數(shù)和模型參數(shù)等見表3注。

2.4 天然牧草CNCPS組分模型預(yù)測效果分析

通過預(yù)測標準誤差(SEP)、預(yù)測值與化學(xué)值的相關(guān)系數(shù)(RSQ)、外部驗證相對分析誤差(RPDP)，用驗證集樣品對模型進行外部驗證，評價實際預(yù)測效果，進一步檢驗其優(yōu)劣。對驗證集樣品的預(yù)測值和化學(xué)值進行成對數(shù)據(jù)雙尾t檢驗［20］，用預(yù)測值和化學(xué)值作散點比較兩者相關(guān)性。

蛋白質(zhì)組分各指標模型預(yù)測效果見表5。粗蛋白質(zhì)(CP)的 RPDP為10.95，大于3;其他指標的RPDP均小于2.5。各指標化學(xué)分析值與NIRS預(yù)測值相關(guān)性散點圖見圖 2，PA、PB1、PB2、PB3、PC 的化學(xué)分析值與NIRS預(yù)測值相關(guān)系數(shù)分別為0.82、0.67、0.80、0.64、0.86。

表5 蛋白質(zhì)組分定標模型評價Table 5 The evaluation of calibration model for protein components

各蛋白質(zhì)組分見表1注。SEP:預(yù)測標準誤差;RSQ:NIRS預(yù)測值與實測值的相關(guān)系數(shù);RPDP:外部驗證相對分析誤差(RPDP=SD/SEP)。

圖2 蛋白質(zhì)組分的化學(xué)分析值與NIRS預(yù)測值的相關(guān)性Fig.2 Correlation between measured and NIRS predicted values of protein components

碳水化合物組分各指標模型預(yù)測效果見表6。NDF、ADF、CHO、CNSC 的 RPDP 分別為 5.286、3.787、4.589、4.928，均大于 3;CA、CB1、CB2、CC 的RPDP 分別為 2.138、2.037、1.940、1.464，均小于2.5;CA、CB1、CB2、CC 的化學(xué)分析值與 NIRS 預(yù)測值的相關(guān)系數(shù)分別為 0.89、0.93、0.85、0.68?；瘜W(xué)分析值與NIRS預(yù)測值相關(guān)性見圖3。

表6 碳水化合物組分定標模型評價Table 6 The evaluation of calibration model for carbohydrates components

各碳水化合物組分見表2注。SEP:預(yù)測標準誤差;RSQ:NIRS預(yù)測值與實測值的相關(guān)系數(shù);RPDP:外部驗證相對分析誤差(RPDP=SD/SEP)。

圖3 碳水化合物組分的化學(xué)分析值與NIRS預(yù)測值相關(guān)性分析Fig.3 Correlation between measured and NIRS predicted values of carbohydrates components

3 討論

3.1 近紅外光譜技術(shù)對天然牧草常規(guī)營養(yǎng)成分的預(yù)測

NIRS在牧草營養(yǎng)分析方面的應(yīng)用起步較晚，但是營養(yǎng)成分分析是NIRS技術(shù)的傳統(tǒng)應(yīng)用領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者對牧草、秸稈類粗飼料中營養(yǎng)成分進行了大量研究，建立了NIRS預(yù)測模型。Arminda等［21］建立的多花黑麥草(Lolium multiflorum)的CP、NDF、ADF、CF(粗纖維)、ASH(粗灰分)含量預(yù)測模型，定標決定系數(shù)均在0.9以上。Dale等［22］利用NIRS建立紫花苜蓿的CF、NDF、ADF、ADL含量預(yù)測模型，預(yù)測標準誤差(SEP)分別為1.058、0.964、1.041、1.209。石丹等［23］首次建立了適合中國北方不同區(qū)域、不同生育期、不同干燥方式的羊草干草CP、NDF、ADF的NIRS預(yù)測模型，預(yù)測值與化學(xué)分析值的相關(guān)系數(shù)分別為0.963 7、0.959 4、0.947 9。

本研究建立了天然牧草中蛋白質(zhì)組分和碳水化合物組分的NIRS模型。其中，CP的1-VR為0.989，RPDCV(9.336)和RPDP(10.95)均大于3;NDF、ADF、CHO、CNSC 含量模型的1-VR 值分別為0.975、0.932、0.964、0.966，RPDCV 值和 RPDP 值均大于 3。SP的 1-VR值為 0.717，比 Carmen等［24］報道的結(jié)果好，說明利用NIRS分析技術(shù)對該成分進行定量分析是可行的，但其預(yù)測精度有待于進一步提高。ADL的1-VR值(0.710)比較低，模型需要進一步優(yōu)化。

3.2 近紅外光譜技術(shù)對天然牧草CNCPS組分的預(yù)測

建立天然牧草中CNCPS組分校正模型的難度很大。其原因有:①測定指標多。CNCPS體系通過測定常規(guī)蛋白質(zhì)、碳水化合物等23個指標，區(qū)分了非蛋白質(zhì)氮與真蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)性碳水化合物與非結(jié)構(gòu)性碳水化合物，真實地反映飼料的特性及動物對其利用情況，能夠全面反映飼料的營養(yǎng)成分。②計算步驟繁雜，難免誤差累積。例如，通過NPN、SP、ADIP和NDIP等的測定值計算PA、PB1、PB2、PB3、PC 含量，計算結(jié)果難免會受測定值準確度的影響。NPN、SP、ADIP和 NDIP等的測定比較繁瑣，ADIP的測定又受到ADF的影響，誤差隨測定步驟的增加而積累，并通過CNCPS的計算公式而擴大。

本試驗中 CNCPS蛋白質(zhì)組分 PA、PB1、PB2、PB3、PC的模型預(yù)測值與化學(xué)分析值的相關(guān)系數(shù)分 別 為 0.821、0.674、0.798、0.635、0.862，Carmen等［24］的試驗結(jié)果依次為 0.467、0.054、0.051、0.734、0.747，相 比 較 可 知，本 研 究CNCPS蛋白質(zhì)組分預(yù)測模型精度較好，但是比陳龍等［10］的結(jié)果差?？赡苁菢悠返脑?，本試驗選用的樣品為天然牧草，與單種牧草的模型相比較，天然牧草樣品中各營養(yǎng)成分的組成和含量更加復(fù)雜，對光譜數(shù)據(jù)和化學(xué)分析值的影響較大。CNCPS體系中將碳水化合物分為快速降解糖(CA)、中速降解淀粉(CB1)、慢速降解有效細胞壁部分(CB2)、不可利用的細胞壁部分(CC)。各組分的計算結(jié)果會受其他組分的交叉影響，一種組分的分析誤差都會影響其他指標，甚至導(dǎo)致誤差累積。可見，準確的化學(xué)值測定是指標模型建立的基礎(chǔ)。Chen等［25］研究結(jié)果表明，添加新樣品到定標集可以提高模型精度。因此可嘗試添加樣品量、提高實測值精度來優(yōu)化模型。

本試驗以青海省河南縣典型的高山嵩草草地天然牧草為研究對象，探討NIRS定量分析天然牧草CNCPS營養(yǎng)成分的可行性。采用改進偏最小二乘法，建立了天然牧草常規(guī)蛋白質(zhì)組分和碳水化合物組分及CNCPS體系各組分的近紅外定量分析模型。模型預(yù)測效果表明，常規(guī)組分CP、NDF、ADF、CHO、CNSC、PC、CA 含量預(yù)測模型可以實際應(yīng)用。

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