轉(zhuǎn)基因玉米MIR604結(jié)構(gòu)特異片段實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法的建立

常麗娟， 宋 君， 雷紹榮， 尹 全， 王 東， 劉文娟， 張富麗

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川 成都 610066)

轉(zhuǎn)基因玉米MIR604是瑞士先正達(dá)公司2005年研發(fā)的抗蟲玉米，該品系采用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入來自蘇云金芽孢桿菌的Cry3A基因，該基因編碼的毒素蛋白由3個(gè)不連續(xù)的結(jié)構(gòu)域組成，對(duì)鞘翅目昆蟲具有特異毒性［1］。自2007年起，MIR604先后在美國、菲律賓、俄羅斯、韓國和日本等多個(gè)國家被批準(zhǔn)作為食品和飼料的加工原料。中國于2008年批準(zhǔn)進(jìn)口MIR604作為食品和飼料的加工原料。按照中國轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)管理辦法規(guī)定，MIR604及其加工產(chǎn)品必須進(jìn)行標(biāo)識(shí)。目前，中國轉(zhuǎn)基因生物安全檢測(cè)體系中只有MIR604及其加工產(chǎn)品的定性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)［2］，尚無相關(guān)的定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。歐盟曾經(jīng)發(fā)布過基于TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)［3］，但國內(nèi)尚未對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行驗(yàn)證。為了研制適合中國實(shí)驗(yàn)室的定量檢測(cè)方法，本研究擬探索建立轉(zhuǎn)基因玉米MIR604結(jié)構(gòu)特異片斷實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)方法，并對(duì)該方法的特異性、準(zhǔn)確度及靈敏度進(jìn)行分析，為中國轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 含量為1%和10%的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Certified reference material，CRM)及其他轉(zhuǎn)基因作物粉末材料均購自歐盟聯(lián)合研究中心測(cè)量與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究所(IRRM，Institute for Reference Materials and Measurements，Joint Research Centre，Belgium);非轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、大豆、棉花、油菜、甜菜材料由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑與儀器 植物基因組DNA純化試劑和實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑購自TIANGEN?天根生化科技(北京)有限公司。超微量分光光度計(jì)Nanodrop?1000，由Thermo Fisher Scientific Corporation生產(chǎn)。實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)Real Time PCR System 7500，由美國Applied Biosystem Corporation生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的分離與純化 按照植物基因組DNA純化試劑盒［(TIANGEN?，天根生化科技(北京)有限公司)］說明書分離、純化轉(zhuǎn)基因玉米MIR604基因組DNA。

1.2.2 引物和探針設(shè)計(jì) 玉米內(nèi)標(biāo)基因zSSIIb采用國家標(biāo)準(zhǔn) GB19495.4-2004 中的引物序列［4］;根據(jù) MIR604的載體序列(http://www.shgmo.org/welcome.html)設(shè)計(jì)引物和探針構(gòu)建MIR604特異性片斷(表1)。

表1 轉(zhuǎn)基因玉米MIR604定量檢測(cè)的引物和探針Table 1 The primers and probes used for the quantitative detection of genetically modified maize MIR604

1.2.3 反應(yīng)體系及條件 取4.0μl DNA加入到20.0μl反應(yīng)體系［TaqMan Master mix(2×)10.0 μl，上下游引物(10 μmol/L)各 1.0 μl，探針(10 μmol/L)0.5 μl，補(bǔ)水至20.0 μl］，運(yùn)行程序如下:95℃預(yù)變性10 min，1個(gè)循環(huán);95℃變性15 s，59℃退火60 s，45個(gè)循環(huán)。

1.2.4 方法的特異性、準(zhǔn)確度和靈敏度檢測(cè)

1.2.4.1 特異性 對(duì)非轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、大豆、棉花、油菜、甜菜以及17個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體、5個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)化體、5個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體、3個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)化體、3個(gè)轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn)化體和1個(gè)轉(zhuǎn)基因甜菜轉(zhuǎn)化體進(jìn)行了特異性檢測(cè)，確定方法的特異性。

1.2.4.2 準(zhǔn)確度 分別提取1%和10%的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604基因組DNA，將10%MIR604基因組DNA按照 1∶5梯度稀釋成42.00 ng、8.40 ng、1.68 ng、0.34 ng、0.07 ng，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以 1%MIR604基因組DNA為檢測(cè)樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)樣品重復(fù)24次擴(kuò)增反應(yīng)，計(jì)算1%MIR604標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測(cè)量值。

1.2.4.3 靈敏度 將轉(zhuǎn)基因玉米 MIR604的基因組DNA模板按照 1∶2梯度稀釋成0.22 ng、0.11 ng、0.06 ng、0.03 ng、0.01 ng，每個(gè)梯度重復(fù) 8 次擴(kuò)增反應(yīng)。根據(jù)玉米基因組大小，計(jì)算出每個(gè)梯度反應(yīng)體系中MIR604分子片段的拷貝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的特異性

采用本方法設(shè)計(jì)的引物和探針對(duì)6種非轉(zhuǎn)基因作物、轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其他非目標(biāo)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行檢測(cè)，只有MIR604檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)(圖1)，其他非轉(zhuǎn)基因作物和非目標(biāo)轉(zhuǎn)基因作物均未檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)，顯示本研究建立的檢測(cè)方法具有很高的特異性。

圖1 轉(zhuǎn)基因玉米MIR604擴(kuò)增的特異性Fig.1 The specificity of the method for detection of genetically modified maize MIR604

2.2 方法的準(zhǔn)確度

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，用10%轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)1%MIR604進(jìn)行定量檢測(cè)，并連續(xù)重復(fù)24個(gè)平行樣品。玉米內(nèi)源基因zSSIIb的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 Y=－3.40x+31.72，R2為 0.996，擴(kuò)增效率為 96.76%(圖 2A);MIR604分子片段的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=－3.29x+33.08，R2為 0.997，擴(kuò)增效率為 101.49%(圖 2B)。說明設(shè)計(jì)的引物和探針擴(kuò)增效率高，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的數(shù)據(jù)對(duì)之間的線性關(guān)系好。采用本研究建立的方法對(duì)1%MIR604標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)，測(cè)試樣品平均相對(duì)含量為1.05%，測(cè)量值與真實(shí)值的相對(duì)偏差為5%，方法具有較高的準(zhǔn)確度。

2.3 方法的靈敏度

為了確認(rèn)方法的靈敏度，分別以不同拷貝數(shù)的DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增，8次重復(fù)都有擴(kuò)增信號(hào)的最低外源片段分子拷貝數(shù)為本方法的檢測(cè)下限。試驗(yàn)結(jié)果表明本方法最低能檢測(cè)到約為5個(gè)拷貝的MIR604核酸分子片段(表2)。

圖2 特異性定量PCR方法擴(kuò)增曲線Fig.2 The amplification curves for the construct-specific quantitative PCR method

表2 轉(zhuǎn)基因玉米MIR604結(jié)構(gòu)特異片段檢測(cè)的靈敏度Table 2 The sensitivity of the method for detection of constructspecific fragment of genetically modified maize MIR604

3 討論

熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR可分為SYBR Green I染料法和TaqMan探針法。轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)普遍采用TaqMan探針法。與SYBR Green I染料法相比［5］，TaqMan探針法由于要求引物和探針都要與DNA模板配對(duì)，在擴(kuò)增反應(yīng)過程中，通過外切核酸酶切斷與探針連接的熒光蛋白而產(chǎn)生熒光信號(hào)，排除了引物二聚體和非特異性擴(kuò)增DNA片段所產(chǎn)生的熒光信號(hào)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾，在對(duì)數(shù)擴(kuò)增期收集的熒光信號(hào)只來源于目的基因的擴(kuò)增，所以TaqMan探針法具有更高特異性和更可靠的檢測(cè)結(jié)果。

轉(zhuǎn)基因玉米MIR604投放市場(chǎng)后，歐盟、日本和韓國等先后建立了其實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，歐盟還在此基礎(chǔ)上建立起了MIR604熒光定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。日本和韓國［6-7］建立了MIR604品系特異熒光定量檢測(cè)方法，通過對(duì)方法特異性、準(zhǔn)確度、靈敏度的評(píng)估，確認(rèn)了方法的可行性。目前，中國尚無MIR604的定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。本研究建立的方法標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率在－3.6至－3.1之間，擴(kuò)增效率在90%至110%的范圍內(nèi)，決定系數(shù)大于0.99，符合TaqMan探針法要求［8］;檢測(cè)的最低含量為 5個(gè)拷貝的MIR604分子片段。表明，該方法具有特異性好、準(zhǔn)確度高和靈敏度高的特點(diǎn)，可作為轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的定量檢測(cè)方法。

［1］ 袁美妗，鄧日強(qiáng)，胡曉暉，等.蘇云金芽孢桿菌cry1Aa和cry3A結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)的融合［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2002，10(3):287-290.

［2］ 農(nóng)業(yè)部1485號(hào)公告-16-2010.抗蟲玉米MIR604及其衍生品種定性PCR方法［S］.

［3］ CRLVL04/05VP.Event-specific method for the quantification of maize line MIR604 using real-time PCR［S］.

［4］ GB19495.5-2004.轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸定量PCR檢測(cè)方法［S］.

［5］ ROTT M E，LAWRENCE T S，WALL E M.Development of realtime PCRsystems based on SYBRGreen Iamplifluore and Taqman technologies for specific quantitative detection of the transgenic maize event GA21［J］.Cereal Science，2004，39:99-107.

［6］ JUNICHI M，SATOSHI F，KAORI T，et al.Development and validation of event-specific quantitative PCR method for genetically modified maize MIR604［J］.Food Hyg Saf Sci，2012，53(4):166-171.

［7］ KIM J H，KIM H Y.Event-specific detection methods for genetically modified maize MIR604 using real-time PCR［J］.Food Science and Biotechnology，2009，18(5):1118-1123.

［8］ 張廣遠(yuǎn)，孫紅煒，李 凡，等.轉(zhuǎn)基因玉米 MIR162轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)方法及其標(biāo)準(zhǔn)化［J］.作物學(xué)報(bào)，2013，39(7):1141-1147.