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    小麥籽粒蛋白質(zhì)雙向電泳體系的優(yōu)化

    2015-03-15 12:32:28葉景秀
    關(guān)鍵詞:雙向電泳膠條樣量

    葉景秀

    (青海省農(nóng)林科學(xué)院,青海 西寧 810016)

    小麥籽粒灌漿對(duì)產(chǎn)量及品質(zhì)至關(guān)重要。前人的工作主要集中在生理生化水平的研究上,例如分析不同因素對(duì)灌漿特性的影響[1-3],淀粉的積累規(guī)律[4],各種酶的變化規(guī)律等[5]。然而,籽粒的灌漿是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過(guò)程,僅從生理生化水平無(wú)法深層次地揭示其機(jī)制。

    目前,隨著植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的日漸成熟,植物蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷更新,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在水稻[6]、小麥[7]、擬南芥[8]、大豆[9]、煙草[10]等作物中的研究報(bào)道日益增多。以植物蛋白質(zhì)的提取、雙向電泳分離、質(zhì)譜鑒定等先進(jìn)技術(shù)相結(jié)合,應(yīng)用于小麥蛋白質(zhì)組學(xué)的研究主要集中于小麥的根、葉片、花藥、花粉等組織器官蛋白質(zhì)的雙向電泳分析及相關(guān)蛋白質(zhì)功能的初步鑒定,然而,由于受籽粒中多糖等物質(zhì)的影響,較難提取籽粒總蛋白質(zhì),影響了蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在籽粒中的應(yīng)用。在前人已發(fā)表的關(guān)于籽粒蛋白質(zhì)組學(xué)研究的文獻(xiàn)中,對(duì)不同作物所采取的蛋白質(zhì)提取方法各不相同。王慧娜等[11]在不同方法提取的小麥籽粒蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠分離效果的分析比較一文中只介紹了提取方法對(duì)雙向電泳分離效果的影響,而影響雙向電泳效果的因素不僅僅是蛋白質(zhì)樣品的制備還包括蛋白質(zhì)上樣量、分離膠濃度、合適的膠條pH值等。因此,本研究對(duì)2種常用的植物組織蛋白質(zhì)提取方法進(jìn)行比較,并對(duì)雙向電泳過(guò)程中膠條pH值、蛋白質(zhì)上樣量和分離膠濃度等方面進(jìn)行優(yōu)化,以期探索出一套適合于小麥籽粒蛋白質(zhì)雙向電泳的技術(shù)體系,為今后開展小麥籽粒蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供技術(shù)支撐。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    小麥青春38為青海省農(nóng)林科學(xué)院自育品種,2013年種植于青海省農(nóng)林科學(xué)院試驗(yàn)地,按常規(guī)技術(shù)栽培管理,乳熟期和蠟熟期分別取穗中部籽粒,以液氮速凍,置-80℃冰箱保存。

    1.2 儀器和試劑

    PROTEAN IEF Cell等電聚焦系統(tǒng)、PROTEANⅡxi Cell垂直電泳系統(tǒng)、PDQuest 8.0.1凝膠圖像分析軟件均為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品,UMAX Power-Look 2100XL光密度掃描儀為臺(tái)灣力捷公司產(chǎn)品,pH 4~7和pH 5~8線性IPG膠條、兩性電解質(zhì)等為Bio-Rad公司產(chǎn)品,苯甲基磺酰氟(PMSF)、β-巰基乙醇(β-ME)、二甲氨基丙磺酸(Chaps)、丙烯酰胺(Acrylamide)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis-acrylamide)、四甲基乙二胺(TEMED)、二硫蘇糖醇(DTT)、過(guò)硫酸銨、碘乙酰胺、尿素為Sigma和Thermo公司產(chǎn)品,其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 籽??偟鞍踪|(zhì)的提取 TCA(三氯乙酸)/丙酮沉淀法:小麥籽粒加液氮研磨成粉末,參照陳蕊紅等[12]的TCA丙酮法提取總蛋白質(zhì),略有改動(dòng)。用-20℃預(yù)冷蛋白質(zhì)提取液(8%TCA,0.07%β-ME,1 mmol/L PMSF)沉淀蛋白質(zhì),置-20℃沉淀過(guò)夜,期間振蕩多次,4℃,14 000 r/min離心30 min,棄上清,沉淀用預(yù)冷丙酮溶液(含0.07% β-ME、1 mmol/L PMSF)洗滌,-20℃ 靜置1 h后,4℃、14 000 r/min離心30 min,重復(fù)4~5次,直至蛋白質(zhì)沉淀物為純白色,將沉淀真空冷凍成干粉,-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩7犹崛》?小麥籽粒加液氮研磨成細(xì)粉,轉(zhuǎn)移至離心管加適量提取液(0.1 mol/L Tris-HCl,pH8.0,1%DTT,0.9 mol/L蔗糖,1 mmol/L PMSF),攪勻,4℃放置5 min;4℃、14 000 g離心20 min,在上清液中加入等體積的 Tris飽和酚(pH 8.0),充分振蕩混勻,4℃靜置1 h,離心(4℃,9 000 g,5 min),收集酚相,加入3倍體積預(yù)冷的甲醇溶液(含0.1 mol/L醋酸銨),混勻后-20℃過(guò)夜,4℃、18 000 g離心30 min,棄上清收集沉淀,沉淀用-20℃預(yù)冷丙酮溶液(含0.1%DTT)洗滌,離心(4℃,18 000 g,30 min),重復(fù)洗滌過(guò)程2~3次,直至蛋白質(zhì)沉淀物為純白色,將沉淀真空冷凍成干粉,-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.2 蛋白質(zhì)的裂解與定量 將蛋白質(zhì)干粉溶解于水化液(8 mol/L尿素,2 mol/L硫脲,4%Chaps,65 mmol/L DTT,0.5%載體兩性電解質(zhì)),32℃水浴30 min,振蕩充分混勻后用液氮冷卻,此過(guò)程重復(fù)2次,于20℃下14 000 r/min離心15 min,吸取上清備用。蛋白質(zhì)濃度測(cè)定參考考馬斯亮藍(lán)Bradford法。

    1.3.3 蛋白質(zhì)雙向電泳(2D-PAGE) 主要按IPG-phor等電聚焦系統(tǒng)指南進(jìn)行。取適量蛋白質(zhì)樣品與水化液(加入痕量0.001%溴酚藍(lán))充分混合至380 μl,沿 PROTAIN IEF Cell型電泳儀(BIO-RAD)聚焦槽內(nèi)連續(xù)加入,將17 cm IPG膠條膠面朝下覆蓋在樣品上,被動(dòng)吸收1 h后,加3 ml礦物油覆蓋膠條,置于IPG等電聚焦儀的電極板上,在20℃條件下主動(dòng)水化15 h使膠條充分吸脹,吸收樣品,然后以每根50μA的極限電流按表1程序進(jìn)行第1向等電聚焦電泳。等電聚焦結(jié)束后,膠條分別在平衡緩沖液Ⅰ(6 mol/L 尿素,2%SDS,0.375 mol/L Tris-HCl,20%甘油,使用時(shí)加2%DTT)和平衡緩沖液Ⅱ(6 mol/L 尿素,2%SDS,0.375 mol/L Tris-HCl,20% 甘油,使用時(shí)加2.5%碘乙酰胺)中平衡15 min。第2向SDS-PAGE用12%和13%分離膠。凝膠染色采用硝酸銀染色法,其過(guò)程依次是:超純水洗2次,每次2 min,固定液[10%冰乙酸(體積比)+40%無(wú)水乙醇(體積比)]固定2.5 h,超純水快速?zèng)_洗2次,敏化液[30%甲醇(體積比)+0.2%硫代硫酸鈉(質(zhì)量體積比)+6.8%乙酸鈉(質(zhì)量體積比)]中30 min,超純水水洗3次,每次5 min,硝酸銀[0.25%硝酸銀(質(zhì)量體積比)]染色20 min,快速漂洗2次,顯影液[2.5%無(wú)水碳酸鈉(質(zhì)量體積比)+0.04%甲醛(質(zhì)量體積比)]顯影后加終止液[10%冰醋酸(體積比)]終止反應(yīng)。

    表1 等電聚焦電泳程序Table 1 Procedures of isoelectric focusing electrophoresis

    1.3.4 圖譜掃描與分析 用 UMAX PowerLook 2100XL型光密度掃描儀透射掃描染色后的雙向電泳凝膠獲取圖像,分辨率設(shè)為600 dpi,在PDQuest 2DE 8.0.1分析軟件(美國(guó) Bio-Rad公司)的輔助下,定義蛋白質(zhì)點(diǎn)的大小、強(qiáng)弱,檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)目。

    1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析 用Microsoft Office Excel 2010對(duì)3次重復(fù)的2-DE圖譜上蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    2 結(jié)果

    2.1 不同提取方法對(duì)蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜質(zhì)量的影響

    分別用TCA丙酮沉淀法和酚提取法提取小麥籽??偟鞍踪|(zhì),用蛋白質(zhì)裂解液裂解蛋白質(zhì),用考馬斯亮藍(lán) Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量,以17 cm、pH5~8 IPG膠條進(jìn)行雙向電泳分離,硝酸銀染色。結(jié)果(圖1)顯示,用酚提取法提取的蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜酸性端蛋白質(zhì)點(diǎn)較模糊,分辨率低,橫豎紋干擾嚴(yán)重,堿性端效果稍好,但是檢測(cè)到的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)偏少;而TCA丙酮沉淀法提取的蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠圖譜蛋白質(zhì)點(diǎn)分布均勻,蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰且更豐富,凝膠背景干凈,橫豎條紋干擾少。用PDQuest軟件統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,在相同的參數(shù)條件下,酚提取法可分辨出約260個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn),TCA丙酮沉淀法則可檢測(cè)到約490個(gè)清晰的蛋白質(zhì)點(diǎn),比酚提取法多230個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。說(shuō)明采用TCA丙酮沉淀法提取的小麥籽粒蛋白質(zhì)雙向電泳分離效果較好。

    2.2 不同pH值IPG膠條對(duì)雙向電泳圖譜的影響

    用等電點(diǎn)pH值4~7的IPG膠條進(jìn)行的籽粒蛋白質(zhì)電泳分離結(jié)果表明,蛋白質(zhì)大多集中在堿性端,pH 4~5范圍內(nèi)蛋白質(zhì)點(diǎn)很少;等電點(diǎn)pH 5~8 IPG膠條的電泳分離結(jié)果表明:蛋白質(zhì)點(diǎn)分布較均勻,能更好地滿足研究分析的需求(圖2)。

    圖1 不同方法提取的蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜比較Fig.1 Comparison of 2-DE maps of proteins extracted by two methods

    圖2 不同pH值IPG膠條的雙向電泳圖譜比較Fig.2 2-DE maps of protein in the systems with different p H ranges of IPG

    2.3 上樣量及SDS-PAGE膠濃度對(duì)雙向電泳圖譜的影響

    為了更好地分離蛋白質(zhì),進(jìn)一步比較分析了雙向電泳中不同蛋白質(zhì)上樣量和SDS-PAGE膠濃度。選用17 cm、pH 5~8 IPG 膠條,分別取300μg、380 μg和450μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行雙向電泳,結(jié)果見圖3。在上樣量為300μg時(shí),雙向電泳圖譜上蛋白質(zhì)點(diǎn)模糊不清,低豐度蛋白質(zhì)因不能被檢測(cè)而丟失,影響了雙向電泳的準(zhǔn)確性和重復(fù)性,經(jīng)軟件分析檢出304個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn);在上樣量為450μg時(shí),蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)多,但高豐度蛋白質(zhì)點(diǎn)過(guò)大,出現(xiàn)飽和重疊現(xiàn)象,掩蓋了其他蛋白質(zhì)點(diǎn),而且圖譜上橫條紋比較明顯,影響了蛋白質(zhì)點(diǎn)的分離與分析,經(jīng)軟件分析檢出570個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn);上樣量為380μg時(shí),蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰,無(wú)橫條紋干擾,聚焦效果好,圖譜質(zhì)量最佳,經(jīng)軟件分析檢出516個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。

    圖3 不同蛋白質(zhì)上樣量的雙向電泳圖譜比較Fig.3 2-DE maps of different loading quantities of proteins

    在選用17 cm pH5~8膠條、上樣量380μg的基礎(chǔ)上,分別以12%和13%的SDS-PAGE膠濃度對(duì)小麥籽粒蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分析。分離膠濃度為13%時(shí),高分子量蛋白質(zhì)分離不充分,蛋白質(zhì)擠壓疊加,遮蓋了某些蛋白質(zhì)點(diǎn)在圖譜上的表達(dá),從而降低了分辨率;分離膠濃度為12%時(shí),蛋白質(zhì)分離較好,蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰圓潤(rùn),獲得較好的分離圖譜(圖4)。

    圖4 不同分離膠濃度的雙向電泳圖譜比較Fig.4 2-DE maps of protein in the systems with different gel concentrations

    2.4 雙向電泳圖譜的重復(fù)性分析

    蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的重復(fù)性,是后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果可靠性的基本保障。為分析本研究建立的小麥籽粒蛋白質(zhì)雙向電泳體系的重復(fù)性,在上述優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上,采用嚴(yán)格一致的操作程序,并精確控制電泳溫度與電流電壓,進(jìn)行了3次雙向電泳重復(fù)試驗(yàn)。經(jīng)軟件分析發(fā)現(xiàn),3張圖譜分別檢測(cè)到490、512、531個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。選取其中1張凝膠圖譜作為參考膠,其余圖譜與其進(jìn)行蛋白質(zhì)點(diǎn)匹配分析,平均匹配率達(dá)到96%。蛋白質(zhì)點(diǎn)位置在IPGIEF方向偏移為 (1.79±0.36)mm,在 SDS-PAGE方向偏移為 (1.65±0.41)mm。說(shuō)明所建立的雙向電泳體系重復(fù)性和穩(wěn)定性均較高。

    3 討論

    蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組時(shí)代生命科學(xué)研究的一個(gè)重要領(lǐng)域,蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要性使其相關(guān)技術(shù)得到突飛猛進(jìn)的發(fā)展[13]。其中,雙向電泳作為分離分析蛋白質(zhì)的重要手段,在蛋白質(zhì)組研究中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此,對(duì)雙向電泳條件進(jìn)行優(yōu)化顯得尤為重要。

    樣品制備是雙向電泳的第一步,采用不同方法提取的蛋白質(zhì)電泳效果不同。增廣娟等[14]比較了蘋果葉片蛋白質(zhì)的不同提取方法,結(jié)果表明改良的Tris-HCl提取法的蛋白質(zhì)點(diǎn)最多,雙向電泳效果最好。陳蕊紅等[12]比較分析了不同小麥花藥蛋白質(zhì)提取方法,發(fā)現(xiàn)TCA丙酮法提取效果較好。石海波等[15]對(duì)玉米籽粒蛋白質(zhì)不同提取方法的研究結(jié)果表明,可溶性蛋白質(zhì)提取法獲得的蛋白質(zhì)純度高、濃度適中、雙向電泳蛋白質(zhì)點(diǎn)最豐富,最適合雙向電泳研究。李奇松等[16]對(duì)比了3種不同的蛋白質(zhì)提取方法,結(jié)果表明可溶性蛋白質(zhì)提取法最適用于籽粒蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。本試驗(yàn)對(duì)比分析了用途較為廣泛的TCA丙酮沉淀法和酚提取法,結(jié)果表明TCA丙酮沉淀法比較適用于雙向電泳圖譜分析,這與王慧娜等[11]的研究結(jié)果有分歧,推測(cè)可能與提取過(guò)程中所用的試劑配方不同有關(guān)。

    雙向電泳體系中電泳條件包括膠條pH值、上樣量和SDS-PAGE分離膠濃度等方面[17]。理想的IPG膠條,既要覆蓋樣品中全部蛋白質(zhì)的等電點(diǎn),又不能因等電點(diǎn)相對(duì)集中導(dǎo)致大量蛋白質(zhì)點(diǎn)聚集在一起。本研究根據(jù)前期對(duì)小麥葉片蛋白質(zhì)雙向電泳分離試驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn),首先采用了等電點(diǎn)pH值4~7的IPG膠條對(duì)小麥籽粒蛋白質(zhì)進(jìn)行分離,發(fā)現(xiàn)大部分蛋白質(zhì)集中在堿性端,蛋白質(zhì)點(diǎn)之間緊密相連,甚至重疊在一起,模糊且不易區(qū)分,改用等電點(diǎn)pH 5~8的IPG膠條后,籽粒蛋白質(zhì)分辨率顯著提高,分離效果較好,檢測(cè)到的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)多。

    合適的上樣量和分離膠濃度在雙向電泳中是非常重要的。過(guò)大的上樣量和分離膠濃度,容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)大量聚集,遮蓋部分蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá),無(wú)法反映蛋白質(zhì)組的全部信息;上樣量和分離膠濃度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致一些低分子量和低豐度蛋白質(zhì)超出凝膠所容納的范圍,不能在雙向電泳圖譜上顯現(xiàn)。上樣量的多少與IPG膠條的長(zhǎng)度、pH值和蛋白質(zhì)染色方法密切相關(guān)。本研究在選用長(zhǎng)度17 cm、pH5~8 IPG膠條,采用硝酸銀染色的基礎(chǔ)上借鑒以往的操作經(jīng)驗(yàn),比較了不同上樣量(300 μg、380 μg、450 μg)的雙向電泳效果,結(jié)果表明蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)量隨上樣量的增加而增多,但是當(dāng)上樣量增加到450μg時(shí),蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)量比上樣量380 μg時(shí)略有增多,但是蛋白質(zhì)點(diǎn)之間出現(xiàn)了互相重疊,相互干擾現(xiàn)象,表明380μg的上樣量較佳。在此基礎(chǔ)上比較了分離膠濃度12%和13%的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜,發(fā)現(xiàn)12%的分離膠濃度能夠更有效地分離小麥籽粒蛋白質(zhì)。3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明,本研究建立的雙向電泳體系重復(fù)性較好。

    綜上所述,應(yīng)用本研究建立的雙向電泳體系,能夠獲得重復(fù)性好、蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰、數(shù)量豐富的雙向電泳圖譜,該體系適合于小麥籽粒全蛋白質(zhì)的雙向電泳分析。

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