阿霉素腎病小鼠病理機制中白細(xì)胞介素-18水平分析

匡 穎，秦 達(dá)

(貴州省人民醫(yī)院中心實驗室，貴陽 550002)

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阿霉素腎病小鼠病理機制中白細(xì)胞介素-18水平分析

匡 穎，秦 達(dá)

(貴州省人民醫(yī)院中心實驗室，貴陽 550002)

目的 探討白細(xì)胞介素-18(IL-18)在阿霉素腎病模型(微小病變型腎病，MCN)小鼠病程中的免疫失調(diào)作用。方法 采用阿霉素單次尾靜脈注射昆明種小鼠，誘導(dǎo)形成微小病變型腎病模型，設(shè)置模型組、生理鹽水對照組和IL-18mAb抗體中和實驗組(mAb)。測定3組小鼠第1、2、4、6周24 h尿蛋白(24 hUPQ)水平；于第42天時心臟采血法留取血清，檢測模型組與對照組血清總蛋白(TP)、清蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(Tch)的水平；取單側(cè)腎做病理檢測，同時制備脾淋巴細(xì)胞懸液、腎組織勻漿液檢測3組IL-18、γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及IL-4水平。結(jié)果 模型組小鼠從注射阿霉素第2周起,24 h UPQ值均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；血清TP、ALB、BUN、Cr、Tch、TG結(jié)果和病理診斷結(jié)果顯示，模型小鼠出現(xiàn)低蛋白血癥、高脂血癥等類腎病綜合征癥狀。檢測顯示模型組小鼠血清、腎組織勻漿上清液、脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-18、INF-γ、TNF-α水平均高于對照組，而IL-4水平均低于對照組，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。mAb組小鼠24 hUPQ及IL-18、IFN-γ、TNF-α水平均低于模型組，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 模型小鼠病程中，Th1類細(xì)胞因子分泌增強，Th2類因子受抑制，且IL-18mAb起到部分中和內(nèi)源性IL-18的作用，表明IL-18是小鼠MCN病程中重要的免疫失調(diào)因子。

微小病變型腎?。?阿霉素； 白細(xì)胞介素-18

細(xì)胞免疫反應(yīng)、T細(xì)胞激活及腎間質(zhì)炎性反應(yīng)是腎病綜合征(NS)發(fā)病的重要特征[1]。多種血清活性成分，包括多種免疫活性細(xì)胞源性細(xì)胞因子，可直接造成腎小球的損傷，是誘發(fā)臨床大量蛋白尿的重要因素。而以細(xì)胞介導(dǎo)為主的輔助性T淋巴細(xì)胞亞群(Th1/Th2)免疫反應(yīng)失調(diào)是NS發(fā)病的主要原因[2]。白細(xì)胞介素-18(IL-18)是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，不僅參與先天性或特異性免疫調(diào)節(jié)，且與機體非免疫性預(yù)防機制及炎性過程密切相關(guān)，在自身免疫性疾病的發(fā)病過程中具有重要意義。本研究以阿霉素(ADR)誘導(dǎo)腎病小鼠為實驗?zāi)Ｐ蚚3]，觀察微小病變型腎病(MCN)小鼠IL-18水平的變化，以探討其在NS發(fā)病中的生物學(xué)意義，同時為NS的治療提供新的靶分子和新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性昆明種小鼠36只，體質(zhì)量18～20 g，年齡3～4周。隨機分為模型組16只，對照組20只。

1.2 方法

1.2.1 阿霉素腎病模型小鼠(微小病變型)的建立 單次應(yīng)用阿霉素溶液以7.5 mg/kg 的劑量于尾靜脈內(nèi)注射模型組小鼠，對照組尾靜脈注射等容積生理鹽水。觀察小鼠的生長情況6周，動態(tài)監(jiān)測24 h 尿蛋白量(24 hUPQ)，檢測其他生化指標(biāo)并做病理切片檢測。

1.2.2 動態(tài)尿蛋白定性及定量檢測 阿霉素尾靜脈注射后，代謝籠收集第1、2、4、6周24 h尿液，動態(tài)監(jiān)測各期24 hUPQ。以磺基水楊酸比濁法進(jìn)行尿蛋白定性，顯示模型組小鼠自第3周起均出現(xiàn)蛋白尿(++～+++)，對照組均為(-)。以雙縮脲比色法測定第1、2、4、6周兩組小鼠24 hUPQ。

1.2.3 模型組小鼠腎功能生化指標(biāo)的檢測 實驗第42天，以心臟采血法獲取血清后，采用CK-7型多功能全自動生化儀(美國Beckman公司)分別檢測小鼠血清總蛋白(TP)、清蛋白(ALB)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)及總膽固醇(Tch)、三酰甘油(TG)水平。

1.2.4 腎組織勻漿的制備 實驗第42天，小鼠心臟采血獲取血清后，用10%水合氯醛0.3 mL/100g體質(zhì)量腹腔注射麻醉，剪去左背側(cè)被毛，局部消毒，于背旁正中1 cm處縱切口，暴露單側(cè)腎臟，鈍性分離脂肪囊及腎包膜，去除脂肪囊及腎包膜，稱重約100 mg，加0.5 mL 磷酸鹽緩沖液(PBS)冰浴下制作勻漿，以離心半徑6 cm，3 000 r/min，離心5 min，取0.3 mL上清液，置于-20 ℃凍存?zhèn)錂z。

1.2.5 脾細(xì)胞的體外培養(yǎng) 兩組小鼠飼養(yǎng)至第42天時，心臟取血法處死。無菌取脾臟，用眼科剪剪成1 mm3的小塊，用0.25%的胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液。之后用無菌水除去紅細(xì)胞，以淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液[RPMI-1640，每100 mL含50 U青霉素和50 μg鏈霉素，25 mmol 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，10 mL小牛血清]調(diào)整脾細(xì)胞濃度至1×106/mL，加入5 μg/mL刀豆蛋白A(ConA)作為T淋巴細(xì)胞增殖刺激物，在5% 二氧化碳，37 ℃的環(huán)境下，誘導(dǎo)48 h，收集上清液。

1.2.6 MCN小鼠的內(nèi)源性IL-18中和實驗 單次應(yīng)用阿霉素尾靜脈注射小鼠，即誘導(dǎo)建立MCN小鼠模型后，隨機分成MCN模型組、小鼠IL-18單克隆抗體(IL-18mAb)中和實驗組(簡稱mAb組)。IL-18mAb粉劑以PBS稀釋溶解成0.5 mg/kg、1.0 mg/kg兩種注射劑量，于第5、7、12、21天行小鼠腹腔注射[4]，同步觀察小鼠的生長情況，檢測各項臨床指標(biāo)。

1.2.7 細(xì)胞因子的檢測 以酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測小鼠血清、腎組織勻漿上清液、脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-18及IL-4、γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。

2 結(jié) 果

2.1 兩組小鼠24 hUPQ動態(tài)監(jiān)測結(jié)果比較 從注射阿霉素第2周起模型組各時段24 hUPQ水平均高于對照組，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，至第4周增加最明顯。見表1。

2.2 兩組小鼠血清各生化指標(biāo)比較 與對照組比較，模型組小鼠的TP、ALB均降低，TG、Tch均升高，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組Cr、BUN水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 兩組小鼠24 hUPQ動態(tài)監(jiān)測結(jié)果比較

注：與對照組比較，aP<0.05。

表2 兩組小鼠血清各生化指標(biāo)比較±s)

注：與對照組比較，aP<0.05。

2.3 腎臟病理學(xué)改變 肉眼觀察顯示：模型組小鼠腹腔內(nèi)有一定量的腹水，部分小鼠(12只)腎色蒼白，皮質(zhì)、髓質(zhì)分界不清；對照組無此改變。且模型組小鼠腎體積比對照組大,IL-18mAb中和實驗組小鼠腎體積變化不明顯。蘇木精-伊紅染色鏡檢顯示：模型組小鼠腎小球未見異?；騼H有輕微病變，即缺乏特異的和確定的病理學(xué)異常；對照組無病理改變。電鏡檢查顯示：模型組小鼠腎上皮細(xì)胞腫脹、有空泡形成，腎小球上皮細(xì)胞足突部分融合或融合，見圖1；部分區(qū)域足突甚至消失，見圖1B；對照組小鼠未見上述病理改變。

2.4 兩組小鼠各細(xì)胞因子水平比較 模型組小鼠血清、腎組織勻漿上清、脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-18、IFN-γ、TNF-α水平均高于對照組，IL-4水平均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3～5。

2.5 IL-18mAb阻斷內(nèi)源性IL-18作用 從第2周開始mAb組小鼠24 hUPQ低于模型組，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；MCN小鼠腹腔注射IL-18mAb后從第2周開始，24 hUPQ逐漸減少，至第6周下降程度更明顯。見表6。

圖1 MCN模型組小鼠腎組織病理結(jié)構(gòu)電鏡(×30 000)

2.6 模型組與mAb組小鼠各細(xì)胞因子水平比較 與模型組比較，mAb組小鼠血清、腎組織勻漿上清和脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清IL-18、IFN-γ、TNF-α水平均降低，腎組織勻漿上清和脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清IL-4水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而血清IL-4水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表7～9。

表3 小鼠血清IL-18、IL-4、IFN-γ、TNF-α 水平比較

注：與對照組比較，aP<0.01。

表4 小鼠腎組織勻漿上清液IL-18、IL-4、IFN-γ、TNF-α 水平比較

注：與對照組比較，aP<0.01。

表5 小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-18、IL-4、IFN-γ、TNF-α 水平

注：與對照組比較，aP<0.01。

表6 模型組與mAb組小鼠24 hUPQ比較

注：與模型組比較，aP<0.01。

表7 小鼠血清IL-18、IL-4、IFN-γ、TNF-α 水平比較

注：與模型組比較，aP<0.01。

表8 小鼠腎組織勻漿上清液IL-18、IL-4、IFN-γ、TNF-α 水平比較

注：與模型組比較，aP<0.01。

表9 小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-18、IL-4、IFN-γ、TNF-α 水平比較

注：與模型組比較，aP<0.01。

3 討 論

國外學(xué)者研究證實，MCN的主要發(fā)病機制是免疫性炎癥介導(dǎo)的病理損傷，包括全身性自身免疫性疾病所致的腎病變和腎臟本身特發(fā)性免疫損傷[5-6]。T細(xì)胞功能紊亂與NS關(guān)系密切，各種原發(fā)性和繼發(fā)性腎小球疾病都存在Th1/Th2失衡的情況。在MCN病程中，IL-18既可以誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)，還參與調(diào)節(jié)Th2型反應(yīng)，具有極為重要的生物學(xué)意義。IL-18是一種多功能細(xì)胞因子，有多重生物學(xué)功能[7-8]：可通過增加IL-2R的表達(dá)而促進(jìn)Th1細(xì)胞的形成、誘導(dǎo)Th1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ；能促進(jìn)IL-1和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF) 產(chǎn)生；增強自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的活性，促進(jìn)其釋放穿孔素，發(fā)揮殺傷作用；表達(dá)Fas配體(FasL)，增強FasL介導(dǎo)的細(xì)胞毒性；誘導(dǎo)TNF-α和多種趨化因子的基因表達(dá)與蛋白質(zhì)合成；同時抑制Th2類細(xì)胞因子的生成。

本實驗以阿霉素注射昆明種小鼠建立MCN動物模型，雖然MCN大鼠模型在1982年已由Bertani等研究者建立，但是采用昆明種小鼠建立此腎病模型尚未見資料報道[9]。阿霉素是含醌的蒽環(huán)抗菌藥物，在腎臟內(nèi)被代謝為半醌型自由基，后者與氧反應(yīng)產(chǎn)生活性氧，在多種脂質(zhì)介質(zhì)如血小板活化因子的介導(dǎo)作用下，誘發(fā)腎小球上皮細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而改變腎小球上皮細(xì)胞糖蛋白代謝，破壞腎小球濾過膜的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致膜濾過屏障病變而引起蛋白尿[10]。采用0.75 mg/kg體質(zhì)量尾靜脈注射昆明種小鼠，注藥后第2周出現(xiàn)嚴(yán)重蛋白尿，28 d左右達(dá)高峰，出現(xiàn)明顯低清蛋白血癥、高膽固醇血癥及胸腔積液和腹水。光鏡下腎小球病變甚微，電鏡下觀察見上皮細(xì)胞空泡變性，假絨毛明顯變性，足突廣泛融合，裂隙消失，符合MCN的病理特點。提示MCN小鼠模型建立成功。

實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠血清IL-18、IFN-γ、TNF-α水平明顯高于對照組(P<0.01)，尤其腎組織勻漿上清液、經(jīng)ConA刺激增殖的脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-18表達(dá)水平更為靈敏，說明在疾病的活動期伴有高水平的IL-18的釋放。證實IL-18參與了MCN的腎損傷過程，病程中出現(xiàn)大量蛋白尿。相反，Th2型細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)水平受抑制。即闡明Th1和Th2型反應(yīng)相互拮抗，IL-18在促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子的釋放時，抑制Th2型因子的產(chǎn)生。而Th1/Th2的免疫失衡，導(dǎo)致腎臟的免疫損傷。據(jù)已有的相關(guān)研究推測，IL-18可能通過下列途徑在MCN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[11-12]：(1)通過促進(jìn)TNF-α、IL-1β、IFN-γ等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，引起腎小球微循環(huán)發(fā)生改變，腎小球系膜細(xì)胞活化與增殖，基質(zhì)膨脹；(2)通過促進(jìn)一氧化氮的產(chǎn)生，可能引起腎小球超濾過及持續(xù)血管擴張；(3)通過增強Fas/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用，細(xì)胞凋亡可能在MCN的終末期腎萎縮過程中發(fā)揮重要作用。Fas/FasL途徑是啟動細(xì)胞凋亡的重要途徑之一，推測外周血NK細(xì)胞等分泌FasL可與腎臟固有細(xì)胞表達(dá)的Fas結(jié)合而誘導(dǎo)MCN患者腎臟細(xì)胞凋亡和腎萎縮。但是，IL-18是否能直接引起腎小球系膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)膨脹，則有待于進(jìn)一步研究[13]。

綜上所述，通過建立MCN小鼠模型，多重比對血清、腎組織勻漿上清液及脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-18釋放水平，同時嘗試采用拮抗劑IL-18mAb注射模型小鼠，達(dá)到部分中和內(nèi)源性IL-18的作用、減輕其引起的直接或間接腎損傷作用，有力地證實IL-18在MCN腎損傷免疫病程中起重要甚至關(guān)鍵作用。隨著免疫治療技術(shù)的發(fā)展，設(shè)想可以通過阻斷IL-18的生成或拮抗其作用，減少IL-18所致的多種促炎細(xì)胞因子和凋亡相關(guān)因子的產(chǎn)生，減輕對腎臟的損傷作用，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。 參考文獻(xiàn)

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Analysis on interleukin-18 level in pathomechanism of adriamycin nephropathy mice

KUANGYing,QINDa

(CentralLaboratory,GuizhouProvincialPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou550002,China)

Objective To investigate the immunity dysfunction effect of interleukin-18(IL-18) in the disease course of adriamycin nephropathy mice model(minimal change nephrosis,MCN).Methods Adriamycin(ADR) was given to Kunming mouse by once tail vein injection for inducing the minimal change nephropathy(MCN) model.The model group,normal saline control group and IL-18 antibody neutralization experimental group (mAb group)were set up.The 24 h urine protein quantitation(24 hUPQ) at 1,2 4,6 weeks was detected in the three groups.Serum was prepared by adopting the heart blood collection,and serum total protein (TP),albumin(ALB),blood urea nitrogen(BUN),creatinine(Cr),triglyceride(TG) and the total cholesterol(Tch) levels were detected in the model group and control group.The unilateral kidney was taken for conducting the pathological examination.At the same time the splenic lymphocyte suspension and the renal tissue homogenate were prepared for detecting the IL-18,INF-γ,TNF-α and IL-4 levels.Results 24 h UPQ in the model group was higher than that in the control group from 2 weeks,the difference had statistical significance(P<0.01);the serum TP,ALB,BUN,Cr,Tch,TG and the pathological examination results showed that the model mice appeared the symptoms similar to nephropathy syndrome such as hypoproteinemia,hyperlipemia.The IL-18,INF-γ and TNF-α levels in serum,renal tissue homogenate supernatant and splenic lymphocyte culture supernatant in the model group were higher than those in the control group,while the IL-4 level was lower than that in the control group,the differences between the two groups had statistical significance(P<0.01).The 24 h UPQ,IL-18,IFN-γ and TNF-α levels in the mAb group were lower than those in the model group,the differences had statistical significance(P<0.01).Conclusion The secretion of Th1 type cytokines during the mice disease course is enhanced and Th2 type cytokines are inhibited,moreover IL-18mAb play the role for partially neutralizing endogenous IL-18,which indicating that IL-18 might be an important immunity dysfunction factor in the mice MCN course.

minimal change nephrosis； adriamycin； interleukin-18

匡穎，女，碩士，主管技師，主要從事臨床免疫學(xué)方面的研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.05.018

A

1672-9455(2015)05-0625-03

2014-10-26

2014-12-15)