原發(fā)免疫性血小板減少癥患者PTPN22基因多態(tài)性研究＊

孫志強(qiáng)，何 玲，譚大為，詹 云，趙 靜，鄭 方

（1．貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬白云醫(yī)院血液科 550014；2．貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科 550004；

3．貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院 550004）

原發(fā)免疫性血小板減少性癥（immune thrombocytopenia，ITP）是一種獲得性器官特異性自身免疫性疾?。?］，是臨床最常見(jiàn)的一種血小板減少性疾病。其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，除傳統(tǒng)的體液免疫以及細(xì)胞免疫機(jī)制外，研究發(fā)現(xiàn)ITP在不同種族發(fā)病率有差異，提示ITP的發(fā)病可能與遺傳背景有關(guān)。蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22（protein tyrosine phosphatase nonreceptor 22，PTPN22）基因位于1號(hào)染色體短臂（1p13．3～13．1），作為自身免疫性疾病的易感基因，被認(rèn)為是除了主要組織相容性抗原復(fù)合物（MHC）以外最重要的自身免疫性疾病危險(xiǎn)因子，是從自身免疫角度研究ITP的重要候選基因。本實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)了PTPN22基因＋1858位點(diǎn)（rs2476601）、3′UTR區(qū)rs3811021位點(diǎn)和啟動(dòng)子－1123位點(diǎn)（rs2488457）的單核苷酸多態(tài)性，旨在探討該位點(diǎn)變異與中國(guó)貴州漢族人群ITP發(fā)病的相關(guān)性。

表1 PTPN22 3個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增引物及片段大小

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬白云醫(yī)院和貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科2013年4月至2014年2月住院及門診長(zhǎng)期隨訪的ITP患者100例作為研究對(duì)象，其中，男31例，女69例，年齡14～85歲，平均（41．3±18．468）歲，均為漢族患者，均符合《血液病診斷與療效標(biāo)準(zhǔn)》第2版ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］。同時(shí)，以性別、年齡為匹配因素，選擇貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院健康體檢者100例作為對(duì)照組，其中，男37例，女63例，年齡15～76歲，平均（41．19±15．162）歲，均為漢族人，所選對(duì)象間均無(wú)親緣關(guān)系。

1．2 研究方法

1．2．1 基因組DNA提取 采清晨空腹靜脈血2mL，用EDTA抗凝管抗凝，置于－80℃冰箱中保存。用DNA提取試劑盒（生工SK8224）提取基因組DNA，－20℃冰箱中保存。DNA提取試劑盒由上海生工生物工程股份有限公司提供。

1．2．2 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增及基因型分析 利用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR－RFLP）技術(shù)進(jìn)行PTPN22基因＋1858位點(diǎn)（rs2476601）和3′UTR區(qū)rs3811021位點(diǎn)的多態(tài)性分析，利用序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCRSSP）技術(shù)進(jìn)行啟動(dòng)子－1123位點(diǎn)（rs2488457）的多態(tài)性分析。參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物見(jiàn)表1，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為15．0μL，其中，DNA模板0．5μL，10×Taq緩沖液1．5μL，dNTP混合物0．3 μL，上下游引物各0．2μL，20mmol／L MgCl21．2μL，5U／μL TaqDNA聚合酶0．1μL，不足體積加高壓滅菌水補(bǔ)足；PCRRFLP反應(yīng)條件為95．0℃預(yù)變性5min后95．0℃變性30s，58．0℃退火30s，72．0℃延伸40s，共40個(gè)循環(huán)，最后72．0℃延伸6min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別以限制性內(nèi)切酶酶（RsaI，TaqI）酶切后以3%瓊脂糖凝膠電泳，將擴(kuò)增物（5．0 μL）與溴酚藍(lán)混合后加樣于1×TBE緩沖液中，150V電泳0．5 h。PCR－SSP反應(yīng)條件：96．0℃預(yù)變性1min后90．0℃變性20s，65．5℃退火45s，72．0℃延伸25s，5個(gè)循環(huán)；再95．0℃變性30s，60．0℃退火50s，72．0 ℃延伸30s，21個(gè)循環(huán)；再95．0℃變性25s，55．0℃退火50s，72．0℃延伸30s，4個(gè)循環(huán)；最后20．0℃延伸2min，4．0℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，150V電泳20min。得到擴(kuò)增條帶后，根據(jù)電泳結(jié)果分析每個(gè)個(gè)體基因型。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)算基因型以及等位基因頻率，檢驗(yàn)其是否符合Hardy－Weinberg遺傳平衡定律，基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 PTPN22位點(diǎn)rs2476601和rs3811021基因多態(tài)性檢測(cè)

100例ITP患者及100例對(duì)照者PTPN22基因＋1858位點(diǎn)（rs2476601）均產(chǎn)生了176bp和42bp兩個(gè)片段，即該位點(diǎn)均為C等位基因，未檢測(cè)到T等位基因，未發(fā)現(xiàn)存在突變，無(wú)單核苷酸多態(tài)性（R620W）存在（圖1）。而rs3811021位點(diǎn)PCR片段擴(kuò)增長(zhǎng)度為162bp，該位點(diǎn)的C等位基因可被TaqI酶切產(chǎn)生137bp和25bp兩個(gè)條帶，如圖2。

2．2 PTPN22－1123位點(diǎn)（rs2488457）基因多態(tài)性檢測(cè) PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度為500bp，每份標(biāo)本均用F1及F2進(jìn)行擴(kuò)增，F(xiàn)1對(duì)應(yīng)等位基因C，當(dāng)基因型為CC時(shí)F1可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，得到擴(kuò)增條帶；F2對(duì)應(yīng)等位基因G，當(dāng)基因型為GG時(shí)F2可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，得到擴(kuò)增條帶；當(dāng)基因型為GC時(shí)，F(xiàn)1及F2均可得到擴(kuò)增條帶，見(jiàn)圖3～4。

圖1 PTPN22基因＋1858位點(diǎn)（rs2476601）基因分型圖

圖2 PTPN22基因rs3811021基因分型圖

圖3 引物F1擴(kuò)增C等位基因電泳圖

圖4 引物F2擴(kuò)增G等位基因電泳圖

2．3 PTPN22基因3個(gè)位點(diǎn)的基因型和等位基因分布頻率

2．3．1 PTPN22基因rs2476601位點(diǎn) 對(duì)該位點(diǎn)SNP檢測(cè)的100例ITP患者及100例對(duì)照者中，未檢測(cè)到T等位基因，即沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PTPN22＋1858存在突變。

2．3．2 PTPN22基因rs3811021位點(diǎn) （1）比較ITP組與對(duì)照組總體基因型及等位基因頻率，PTPN22基因rs3811021位點(diǎn)TT、CT、CC 3個(gè)基因型在ITP患者中的頻率分別為52．0%、39．0%、9．0%；在對(duì)照組中分別為 60．6%、36．4%、3．0%（表2）。3種基因型在ITP患者中的頻率與對(duì)照者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝3．686，P＝0．158）。T等位基因、C等位基因在ITP患者中的頻率為71．5%、28．5%；在對(duì)照者中分別為78．8%、21．2%。2個(gè)等位基因在兩組人群中的頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝2．828，P＝0．093）。（2）按性別因素分別比較ITP組與對(duì)照組基因型及等位基因頻率，以ITP組女性及對(duì)照組女性比較，如表3所示，PTPN22基因rs3811021位點(diǎn)TT、CT、CC 3個(gè)基因型在ITP女性患者中的頻率分別為50．7%、42．0%、7．3%；在對(duì)照女性組中分別為 58．1%、37．1%、4．8%。3種基因型在ITP女性患者中的頻率與女性對(duì)照者相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0．835，P＝0．659）。T等位基因、C等位基因在ITP女性患者中的頻率為71．7%，28．3%；在女性對(duì)照者中分別為76．7%，23．4%。兩個(gè)等位基因在兩組女性人群中的頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0．807，P＝0．369）。

表2 PTPN22基因rs3811021位點(diǎn)基因型和等位基因分布比較［n（%）］

3種基因型在ITP男性患者中的頻率與男性對(duì)照者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝5．097，P＝0．078）。T等位基因、C等位基因兩個(gè)等位基因在兩組男性人群中的頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝2．520，P＝0．112）。

表3 PTPN22基因rs3811021位點(diǎn)按性別比較基因型和等位基因分布比較［n（%）］

2．4 PTPN22基因－1123位點(diǎn)（rs2488457） （1）比較ITP組與對(duì)照組總體基因型及等位基因頻率，PTPN22基因rs2488457位點(diǎn)GG、GC、CC 3個(gè)基因型在ITP患者中的頻率分別為27．6%、66．3%、6．1%；在對(duì)照組中分別為32．0%、58．0%、10．0%（表4）。3種基因型在ITP患者中的頻率與對(duì)照者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝1．802，P＝0．406）。C等位基因、G等位基因在ITP患者中的頻率為60．7%、39．2%；在健康對(duì)照者中分別為61．0%、39．0%。兩個(gè)等位基因在兩組人群中的頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0．003，P＝0．954）。（2）按性別因素分別比較ITP組與對(duì)照組基因型及等位基因頻率 以ITP組女性及對(duì)照組女性比較，如表5所示，PTPN22基因－1123位點(diǎn)GG、CG、CC 3個(gè)基因型在ITP女性患者中的頻率分別為23．5%、75．0%、1．5%；在對(duì)照組女性中分別為28．6%、61．9%、9．5%。3種基因型在ITP女性患者中的頻率與健康女性對(duì)照者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝5．106，P＝0．078）。G等位基因、C等位基因在ITP女性患者中的頻率為61．0%、39．0%；在女性對(duì)照者中分別為60．0%、40．0%。兩個(gè)等位基因在兩組女性人群中的頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0．140，P＝0．906）。3種基因型在ITP男性患者中的頻率與男性對(duì)照者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0．503，P＝0．778）。G等位基因、C等位基因2個(gè)等位基因在兩組男性人群中的頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0．174，P＝0．677）。

表4 PTPN22基因－1123位點(diǎn)基因型和等位基因分布比較［n（%）］

表5 PTPN22基因－1123位點(diǎn)按性別比較基因型和等位基因分布比較［n（%）］

2．5 Hardy－Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) 本研究對(duì)照人群中PTPN22基因rs3811021與rs2488457位點(diǎn)的基因型頻率分布符合 Hardy－Weinberg遺傳平衡定律（rs3811021，χ2＝0．775，P＞0．05；rs2488457，χ2＝4．790，P＞0．05），即群體的基因達(dá)到遺傳平衡，樣本選取和實(shí)驗(yàn)分型結(jié)果可靠。

3 討 論

ITP屬于獲得性器官特異性自身免疫性疾病，其病因及發(fā)病機(jī)理尚未完全清楚，大量研究證實(shí)ITP的發(fā)病與免疫功能異常密切相關(guān)。有關(guān)發(fā)病機(jī)制的研究，目前，傳統(tǒng)的理論認(rèn)為，是B細(xì)胞介導(dǎo)的自身抗體的產(chǎn)生導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)破壞血小板過(guò)多，為體液免疫異常所致。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)除了體液免疫外，細(xì)胞免疫在ITP的發(fā)病機(jī)制中也起著重要的作用，其中抗原特異性自身反應(yīng)性T細(xì)胞，特別是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能異常，是ITP免疫發(fā)病的關(guān)鍵因素。另外，ITP作為一種常見(jiàn)的自身免疫性疾病，除上述發(fā)病機(jī)理外，研究者發(fā)現(xiàn)，其在不同種族的發(fā)病率有差異，提示ITP的發(fā)病可能與遺傳背景有關(guān)。近期，至少有12項(xiàng)關(guān)于ITP患者遺傳學(xué)方面的研究顯示，在ITP患者中可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子基因多態(tài)現(xiàn)象，涉及甲基化轉(zhuǎn)移酶基因多態(tài)性［3－4］、CD72基因多態(tài)性［5］、MHC基因表達(dá)［6］等方面的研究。

PTPN22編碼產(chǎn)生淋巴蛋白酪氨酸磷酸酶（1ymphoid protein tyrosine phosphatase，LYP），LYP通過(guò)直接去磷酸化Scr家族的激酶來(lái)抑制TCR信號(hào)途徑，在T細(xì)胞信號(hào)通路中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用［7］。在正常機(jī)體內(nèi)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)于防止自身免疫性疾病的發(fā)生有著極其重要的作用。有理論認(rèn)為PTPN22基因某位點(diǎn)突變可導(dǎo)致該基因活性增加，從而降低調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減弱調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能［8］。另外，PTPN22的活性增強(qiáng)還能提高胸腺細(xì)胞發(fā)育中效應(yīng)性TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的閾值，導(dǎo)致缺乏對(duì)自身反應(yīng)性T細(xì)胞的陰性選擇［9］。通過(guò)上述機(jī)制的作用，PTPN22功能異常可以導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生，并被認(rèn)為是除了MHC以外最重要的自身免疫性疾病危險(xiǎn)因子，是從自身免疫角度研究ITP的重要候選基因。

近年研究發(fā)現(xiàn)，PTPN22基因＋1858位點(diǎn)突變參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生，其單核苷酸多態(tài)性由胞苷酸（C）突變成胸苷酸（T）（C1858T），蛋白水平的第620位由精氨酸（R）突變成色氨酸（W）（R620W），改變了LYP C端的一個(gè)富含脯氨酸基序的P1結(jié)構(gòu)域［10］，而細(xì)胞中LYP正是通過(guò)該結(jié)構(gòu)域與酪氨酸激酶Csk的SH3結(jié)合來(lái)抑制T細(xì)胞信號(hào)，因此，PTPN22＋1858位點(diǎn)突變導(dǎo)致T細(xì)胞活性增加，從而參與多種自身免疫性疾病有關(guān)，如Ⅰ型糖尿病（T1DM）［10］、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）［11］、白癜風(fēng)［12］、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）［13］、ANCA 相關(guān)性小血管炎［14］等，但在不同國(guó)家健康人群中該位點(diǎn)基因型的分布存在地域差異及種族差異，其中在北美地區(qū)1858T最高［13］，由北向南逐漸降低，亞洲地區(qū)如日本［15］未檢測(cè)到該位點(diǎn)的T等位基因。另外，德國(guó) Kahles等［16］關(guān)于PTPN22 C1858T與T1DM的研究表明，女性T1DM組與健康女性對(duì)照組間PTPN22 1858T基因型分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．000 3），但男性T1DM組與健康對(duì)照組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。提示PTPN22C1858T的分布除了地域及種族差異外，可能還存在性別差異。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的是貴州漢族人群中該位點(diǎn)的SNP，同樣未檢測(cè)到單核苷酸多態(tài)性（R620W）存在，這與有關(guān)學(xué)者關(guān)于PTPN22＋1858位點(diǎn)在亞洲國(guó)家如日本及韓國(guó)人群中的基因多態(tài)性分布的研究結(jié)果相一致。這種結(jié)果的出現(xiàn)可能是由地域及人種之間的差異所致，而在亞洲人群中該位點(diǎn)的突變率可能極低。

本研究對(duì)中國(guó)貴州漢族人群PTPN22基因另外兩個(gè)SNP位點(diǎn)（rs3811021、rs2488457）進(jìn)行了檢測(cè)，并針對(duì)性別因素分別對(duì)ITP組及對(duì)照組基因型及等位基因頻率進(jìn)行比較。

PTPN22基因rs3811021位于3，UTR區(qū)，Kyogoku等［13］發(fā)現(xiàn)位于該區(qū)域（rs3811021）的SNP與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病有關(guān)，其機(jī)制可能是通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性及拼接過(guò)程來(lái)改變PTPN22基因活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示該位點(diǎn)TT、CT、CC 3個(gè)基因型在ITP患者中的頻率與對(duì)照者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝3．754，P＝0．153），T等位基因、C等位基因在兩組人群中的頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0．005，P＝0．944）。另外，根據(jù)性別因素比較兩組人群證實(shí)，ITP組與對(duì)照組女性人群中3種基因型及等位基因頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），兩組男性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。表明該位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與ITP發(fā)病無(wú)相關(guān)性，且該SNP位點(diǎn)分布不存在性別差異，這與國(guó)內(nèi)2009年袁鋒等［17］關(guān)于該位點(diǎn)SNP與中國(guó)漢族人群白癜風(fēng)發(fā)病無(wú)顯著相關(guān)性的結(jié)論一致。

PTPN22基因rs2488457位于啟動(dòng)子區(qū)的－1123位點(diǎn)，有學(xué)者對(duì)PTPN22基因的3′UTR區(qū)，啟動(dòng)子區(qū)，1～21號(hào)外顯子進(jìn)行單核苷酸掃描鑒定，研究亞洲人群中PTPN22基因SNP與T1DM的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于啟動(dòng)子區(qū)的－1123位點(diǎn)（rs2488457）的單核苷酸多態(tài)性與亞洲T1DM的發(fā)病具有相關(guān)性。Viken等［18］做了關(guān)于PTPN22基因－1123位點(diǎn)的SNP與挪威人群類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)變異與挪威人群RA的發(fā)病具有相關(guān)性。以上研究顯示，PTPN22基因－1123位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與亞洲及歐洲人群的自身免疫性疾病的發(fā)病具有相關(guān)性。國(guó)內(nèi)也有相關(guān)報(bào)道，如于志云等［19］研究證實(shí)，PTPN22基因啟動(dòng)子的－1123G＞C的SNP與中國(guó)北方漢族人群Graves病的發(fā)生具有相關(guān)性。目前，關(guān)于該位點(diǎn)變異導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生機(jī)制還不完全清楚，可能是通過(guò)影響LYP的轉(zhuǎn)錄效率進(jìn)而對(duì)LYP的表達(dá)產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示該位點(diǎn)GG、GC、CC 3種基因型在ITP患者中的頻率與對(duì)照者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0．441，P＝0．802）。C等位基因和G等位基因在兩組人群中的頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0．094，P＝0．76）。另外，根據(jù)性別因素比較兩組人群證實(shí)，ITP組和對(duì)照組女性人群中3種基因型及等位基因頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），兩組男性比較差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。表明該位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與ITP發(fā)病無(wú)相關(guān)性，且該SNP位點(diǎn)分布不存在性別差異。這與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果不一致，其原因可能與研究的疾病種類不同，實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量多少以及PTPN22基因其他位點(diǎn)的潛在性影響有關(guān)。

綜上所述，PTPN22基因rs2476601這個(gè)SNP位點(diǎn)在中國(guó)貴州漢族人群中不存在，該基因另外2個(gè)SNP位點(diǎn)（rs3811021、rs2488457）與中國(guó)貴州漢族人群ITP的發(fā)病無(wú)顯著相關(guān)性，且該位點(diǎn)分布不存在性別差異。目前，發(fā)現(xiàn)的關(guān)于PTPN22基因的SNP位點(diǎn)有250個(gè)，而本實(shí)驗(yàn)僅僅選擇了其中的3個(gè)，并不能完全代表該基因的全部SNP位點(diǎn)，因此，不能排除PTPN22基因其他位點(diǎn)的SNP參與ITP的發(fā)病。另外，本研究樣本數(shù)量較少，可能存在其他基因潛在影響PTPN22基因表達(dá)等也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。雖然本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)PTPN22基因這3個(gè)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性與ITP發(fā)病具有顯著相關(guān)性，但對(duì)于ITP發(fā)病與PTPN22基因其他SNP位點(diǎn)相關(guān)性研究具有一定的參考價(jià)值，而PTPN22基因其他SNP位點(diǎn)是否與ITP的發(fā)病具有相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究。

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