DHA對IFN－γ誘導(dǎo)的3T3L1脂肪細(xì)胞MHCⅡ及炎癥分子表達(dá)的影響

喻日成，羅建華，范元碩，劉 波

（貴州省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，貴陽550000）

肥胖已成為流行的健康問題，與代謝性疾病，例如胰島素抵抗、2型糖尿病、高血壓、非酒精性脂肪肝以及多囊卵巢綜合征緊密相關(guān)［1］。肥胖相關(guān)的胰島素抵抗的分子機(jī)制目前還不清楚，但是，最近的研究已經(jīng)表明，低度慢性炎癥是發(fā)病的重要因素［2－3］。脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的脂肪細(xì)胞因子啟動(dòng)氧化應(yīng)激和脂肪組織炎癥反應(yīng)，分泌促炎性細(xì)胞因子，包括腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、白細(xì)胞介素－6（IL－6）、白細(xì)胞介素－1β（IL－1β）、單核細(xì)胞趨化因子（MCP－1），導(dǎo)致胰島素抵抗。MHCⅡ相關(guān)基因在脂肪細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中起重要作用。有研究表明在高脂喂養(yǎng)2周的小鼠脂肪細(xì)胞中MHCⅡ相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，并且與脂肪細(xì)胞中的T細(xì)胞促炎因子增加及抗炎因子減少相平行［4］。二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）有抗炎作用，但目前其作用機(jī)制不清楚，有研究表明DHA可以通過抑制TLR2／3／4和TNF－α而產(chǎn)生抗炎作用［5］。本研究主要是探討DHA對IFN－γ誘導(dǎo)的3T3L1脂肪細(xì)胞MHCⅡ及炎癥分子 MCP－1、IL－6、iNOS表達(dá)的影響，進(jìn)而從某方面闡明 DHA的抗炎機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 3T3L1脂肪細(xì)胞（ATCC）；低糖DMEM培養(yǎng)基：Giboco；胎牛血清：Giboco；RNA提取試劑盒：QIAGEN；逆轉(zhuǎn)錄 試 劑 盒：Applied Biosystems；LightCycler?TaqMan?Master：Roche；MCP－1、IL－6、β－actin一抗：BD Biosciences；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗：Santa Cruz。

1．2 3T3L1脂肪細(xì)胞分化 10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液37℃、5%CO2培養(yǎng)3T3L1脂肪細(xì)胞，待細(xì)胞生長至70%左右，胰蛋白酶消化，分別種植在6孔板及24孔板，2d后細(xì)胞生長至100%，去除培養(yǎng)液，加入含10%FBS，1μM地塞米松，0．5mM的IBMX，10μg／mL胰島素的高糖DMEM培養(yǎng)基中分化2d。2d后換成含10%FBS、10μg／L胰島素的DMEM繼續(xù)分化。6d后倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞含有較多脂滴，油紅染色證實(shí)細(xì)胞分化成熟。

1．3 分化成熟的3T3L1脂肪細(xì)胞處理 分化成熟的3T3L1脂肪細(xì)胞加入2ng／mL的IFN－γ，1h后加入200μM 的DHA，24孔板細(xì)胞4h后吸干培養(yǎng)液，加入RLT及β巰基乙醇裂解細(xì)胞，－80℃凍存以備提取RNA。6孔板細(xì)胞加入200μM DHA培養(yǎng)過夜，吸干培養(yǎng)液，用冰PBS液洗3次，加入細(xì)胞裂解液，提取總蛋白。

1．4 real time－PCR檢測MHCⅡ的相關(guān)基因及炎癥分子mRNA表達(dá)

1．4．1 總RNA制備 按QIAGEN試劑盒說明書介紹的方法提取總RNA，采用Nanodrop ND1000測量RNA的濃度。

1．4．2 cDNA合成 按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Biosystems）說明合成cDNA，總反應(yīng)體系20μL，反應(yīng)條件：25℃10min，37℃120 min，85℃5min，4℃后取出樣品－20℃保存。

1．4．3 PCR擴(kuò)增 PCR總反應(yīng)體系為10μL，含cDNA模板2μL，TaqMan?Master 5μL，ddH2O 2．5μL，引物0．5μL。PCR反應(yīng)條件：50℃2min，95℃10min（1個(gè)循環(huán)）；95℃5s，65℃ 1min，72 ℃ 20s（45個(gè)循環(huán)）；72 ℃ 5min（1個(gè)循環(huán)）。每個(gè)real－time PCR重復(fù)3次，以36B4為管家基因，目的基因的相對表達(dá)量通過公式2－ΔΔCt計(jì)算。

1．5 Western blot測量 MCP－1、IL－6、iNOS蛋白的表達(dá)水平（1）收集處理的細(xì)胞，用冰PBS液洗3次，加入細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，通過BCA方法測量蛋白濃度。（2）將30μg的蛋白樣品加入10%SDS－PAGE點(diǎn)樣孔，100v電壓電泳1h。（3）電泳完的凝膠轉(zhuǎn)PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉，加 MCP－1、IL－6、iNOS及β－actin一抗4℃過夜，TBST洗3次，加辣根過氧化物酶酶標(biāo)記的二抗常溫下30min，TBST洗3次。（4）化學(xué)發(fā)光法顯影、定影，將膠片進(jìn)行掃描拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的相對分子質(zhì)量和凈光密度值。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，數(shù)據(jù)以x±s表示，組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 DHA對IFN－γ誘導(dǎo)的3T3L1脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 3T3L1脂肪細(xì)胞加IFN－γ誘導(dǎo)后IL－6、iNOS、MCP－1表達(dá)均明顯升高（P＜0．05），表明IFN－γ可誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。IFN－γ誘導(dǎo)后加入200μM 的DHA后，IL－6、iNOS表達(dá)出現(xiàn)明顯的下降（P＜0．05），有而 MCP－1表達(dá)雖然有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），見圖1～2。這些結(jié)果表明DHA對IFN－γ誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有抑制作用。

圖1 DHA對IFN－γ誘導(dǎo)的3T3L1脂肪細(xì)胞炎癥因子IL－6、iNOS、MCP－1mRNA相對表達(dá)量的影響

圖2 DHA對IFN－γ誘導(dǎo)的3T3L1脂肪細(xì)胞炎癥因子IL－6、iNOS、MCP－1蛋白相對表達(dá)量的影響

2．2 DHA對IFN－γ誘導(dǎo)的3T3L1脂肪細(xì)胞MHCⅡ相關(guān)基因表達(dá)的影響 3T3L1脂肪細(xì)胞加IFN－γ誘導(dǎo)后MHCⅡ相關(guān)基因Ciita、H2Ab1表達(dá)明顯升高（P＜0．01），加入200μM的DHA后，Ciita、H2Ab1的基因表達(dá)明顯下降（P＜0．05），見圖3。IFN－γ可誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞 MHCⅡ相關(guān)基因的表達(dá)，而DHA對這種誘導(dǎo)有抑制作用。

圖3 DHA對3T3L1脂肪細(xì)胞IFN－γ誘導(dǎo)后MHCⅡ相關(guān)基因Ciita、H2Ab1表達(dá)影響

3 討 論

脂肪組織不僅是一種儲(chǔ)能器官，而且還可以作為一種內(nèi)分泌器官分泌多種生物活性物質(zhì)［6－7］。由脂肪組織分泌的細(xì)胞因子有促炎和抗炎作用，促炎性因子分泌增加可導(dǎo)致胰島素抵抗及多種代謝性疾病如糖尿病、冠心病、高血壓。Visser等［8］研究表明肥胖患者血液中的炎癥標(biāo)記物CRP明顯升高。研究結(jié)果表明，分化成熟的3T3L1細(xì)胞加入IFN－γ誘導(dǎo)后，炎癥分子IL－6、iNOS、MCP－1明顯升高。IL－6在脂肪組織中高表達(dá)，與肥胖及胰島素抵抗密切相關(guān)，IL－6可通過增加肝細(xì)胞SOCS3的表達(dá)介導(dǎo)胰島素抵抗［9］。MCP－1（CCL2）在脂肪炎癥及胰島素抵抗中的作用尚不清楚，Kanda等［10］研究發(fā)現(xiàn)在肥胖狀態(tài)MCP－1與巨噬細(xì)胞浸潤入脂肪組織，胰島素抵抗及非酒精性肝硬化有關(guān)。MCP－1誘導(dǎo)蛋白導(dǎo)致3T3L1細(xì)胞活性氧／氮自由基（ROS／RNS）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER）及iNOS的增加。

DHA具有抗炎的作用，但其作用機(jī)制不清楚。DHA通過抑制多不飽和脂肪酸代謝限速酶基因FADS1，減少非酒精性脂肪肝的炎癥、纖維化及氧化應(yīng)激［11－12］。Oh等［5］研究證實(shí)DHA可以通過抑制巨噬細(xì)胞的G蛋白耦聯(lián)受體－120減小炎癥及胰島素抵抗。本研究發(fā)現(xiàn)DHA可以抑制IFN－γ誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞炎癥因子IL－6、iNOS的表達(dá)，脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的減少有利于改善外周的胰島素抵抗。本研究中DHA對脂肪細(xì)胞MCP－1的表達(dá)無明顯影響。亦有研究表明 MCP－1基因缺陷的小鼠中脂肪細(xì)胞的炎癥反應(yīng)無明顯改變［13］。

IFN－γ誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞MHCⅡ表達(dá)上調(diào)，脂肪細(xì)胞可作為一種抗原提呈細(xì)胞活化T細(xì)胞，T細(xì)胞活化后可促使巨噬細(xì)胞M1化，分泌多種促炎因子，導(dǎo)致胰島素抵抗［14］。CIITA作為轉(zhuǎn)錄激活因子調(diào)控 MHCⅡ的表達(dá)。Gyllenberg等［14］研究發(fā)現(xiàn)與年齡相關(guān)的CIITA等位基因頻率變化與1型糖尿病相關(guān)。本研究表明DHA能降低IFN－γ誘導(dǎo)的MHCⅡ相關(guān)基因Ciita、H2Ab1的表達(dá)。MHCⅡ相關(guān)基因表達(dá)的下調(diào)可以減少脂肪炎癥反應(yīng)，因此，作者推測DHA是否通過抑制IFN－γ誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞MHCⅡ表達(dá)的下調(diào)從而減少脂肪細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

DHA具有明顯的抗氧化及抗炎作用，它對脂肪細(xì)胞的炎癥及MHCⅡ相關(guān)基因的表達(dá)有明顯的作用，通過減少脂肪細(xì)胞的炎癥從而改善胰島素抵抗，在與肥胖相關(guān)的代謝性疾病中有積極的作用，但未來需進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制。

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