抑制MEK／ERK通路對孤獨癥模型大鼠病癥行為的影響＊

戴旭芳，秦利燕

（1．重慶師范大學(xué)教育科學(xué)學(xué)院特殊教育系，重慶400047；2．重慶市特殊兒童心理診斷與教育技術(shù)重點實驗室，重慶400047；3．第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院輸血科，重慶400038）

孤獨癥（autism）又稱兒童自閉癥，是一種兒童腦發(fā)育障礙綜合征，主要臨床特征為交往障礙、語言障礙和（或）重復(fù)刻板行為等。發(fā)病率為2‰～6‰［1］。當(dāng)前，中國約有60多萬兒童患孤獨癥，且發(fā)病率呈上升趨勢［2］。導(dǎo)致孤獨癥發(fā)病的原因復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境、教育等多種因素，目前尚未闡明［3］。

研究發(fā)現(xiàn)，編碼 MEK／ERK（extracellular signal－regulated kinase）信號通路相關(guān)基因的缺失與孤獨癥的發(fā)病相關(guān)，如位于16號染色體上ERK1基因的缺失、22號染色體中ERK2基因或 MAPK（mitogen－aetivated protein kinase）基因的缺失均與孤獨癥的發(fā)病密切相關(guān)［4］。進一步研究表明，MEK／ERK信號通路可促進神經(jīng)細胞的凋亡，而孤獨癥模型小鼠大腦皮質(zhì)中 MEK／ERK信號通路過度激活［5］，但抑制 MEK／ERK信號通路能否改善孤獨癥的行為癥狀目前尚未見報道。因此，本課題以孤獨癥大鼠為模型，探討MEK／ERK信號通路的抑制劑U0126（l，4－diamino－2，3－dieyano－l，4－bis［2－aminophenylthio］butadiene）對孤獨癥大鼠病癥的改善作用。

目前，科學(xué)家們已建立了多個孤獨癥動物模型，如病毒感染模型、基因敲除動物模型、VPA處理模型等［6］。在諸多模型中，VPA藥物處理模型應(yīng)用最廣泛。因此，本研究主要以VPA藥物處理的大鼠作為孤獨癥動物模型。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物 本實驗中的Wistar大鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心。雄性Wistar大鼠10只 （體質(zhì)量300～350g），雌性 Wistar大鼠10只（體質(zhì)量200～250g），于第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)。

1．1．2 藥物與試劑 丙戊酸鈉（sodium valproate，VPA）、U0126購自Sigma公司；GAPDH、MEK、磷酸化 MEK、ERK、磷酸化ERK抗體為Cell Signaling公司產(chǎn)品；PVDF膜為美國Bio－Rad公司產(chǎn)品；細胞裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒為江蘇碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品；蛋白Marker及免疫組織化學(xué)染色試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1．2 方法

1．2．1 動物模型制備 根據(jù)Schneider等［6－7］的方法，把雌、雄大鼠合籠，過夜后在雌鼠陰道發(fā)現(xiàn)陰栓者標(biāo)記為妊娠第1天（E1）。所有模型組在E12．5d按600mg／kg劑量腹腔一次性注射VPA，對照組孕鼠腹腔注射等量的生理鹽水。對照組孕鼠所產(chǎn)幼鼠作為對照組，而模型組孕鼠所產(chǎn)幼鼠作為孤獨癥模型組。U0126組及U0126聯(lián)合VPA組從E13d開始按照每天400μg／kg體質(zhì)量在飼料中添加U0126處理大鼠直至幼鼠斷奶；幼鼠出生后第1天記為P1。

1．2．2 社會交往行為檢測 出生后35d，從每組中各選擇6只雄性幼鼠進行檢測。各只檢測鼠間的體重差別小于15g，且分籠飼養(yǎng)。檢測場所為60cm×60cm×60cm的透明三室箱。檢測前1d，將被檢測鼠放入檢測場所預(yù)適應(yīng)環(huán)境。檢測時，1只被測鼠首先被置于中間小室。10min后，在右側(cè)小室放置陌生幼鼠并用鐵絲籠子罩住，在左側(cè)小室放置同樣的空鐵絲籠子。然后打開左、右小室與中間小室的通道，用攝像記錄被檢測鼠的行為，時間為10min。最后借助Any－Maze軟件統(tǒng)計分析被檢測鼠嗅鐵絲籠子與陌生鼠（社交行為）時間及自梳理（非社交行為）時間。

1．2．3 神經(jīng)行為學(xué)檢測 在幼鼠出生后35d進行，被檢測幼鼠的選擇標(biāo)準同上。分別從各組選擇5只幼鼠進行檢測，檢測場所為25cm×25cm×38cm的封閉箱體，箱體中央?yún)^(qū)大小為12cm×12cm。檢測前1d，將被檢測鼠放入檢測場所預(yù)適應(yīng)環(huán)境。檢測時，將被檢測鼠置于檢測場所中央，用攝像記錄被檢測鼠的行為，時長為5min。然后通過Any－Maze軟件系統(tǒng)統(tǒng)計分析被檢測鼠的直立次數(shù)及在中央?yún)^(qū)活動時間。

1．2．4 Western blot檢測 在行為學(xué)檢測完成之后，將幼鼠處死，并立即分離海馬、前額葉皮層和小腦組織。把各組織用組織裂解液勻漿后于冰上放置30min，再以12 000r／min 4℃離心30min。分離上清液，測定蛋白濃度后放置于－80℃冰箱備用。實驗時，把含50μg總蛋白的樣品行SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉后用一抗于4℃孵育過夜，再經(jīng)PBST洗滌后加二抗室溫孵育1h。最后經(jīng)PBST洗滌后用化學(xué)發(fā)光液進行顯影曝光。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19．0統(tǒng)計軟件分析，結(jié)果用x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 U0126處理顯著改善孤獨癥大鼠的社會交往能力 對各組大鼠的社會交往能力分析表明，與對照組相比，VPA組幼鼠社會交往能力明顯下降，表現(xiàn)為不愿接觸新事物，不喜歡與陌生幼鼠接觸，自我梳理時間較長，與孤獨癥兒童的行為吻合。U0126處理組幼鼠的社會交往能力與正常對照組幼鼠比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。而U0126聯(lián)合VPA組幼鼠的社會交往能力與VPA組幼鼠相比則有顯著改善（圖1，表1）。

圖1 各組大鼠的社會交往能力比較

表1 各處理組大鼠的社交活動時間統(tǒng)計分析結(jié)果（x±s，min，n＝5）

2．2 U0126處理明顯改善孤獨癥大鼠的焦慮行為

2．2．1 U0126處理減少孤獨癥幼鼠在中央?yún)^(qū)活動時間 行為檢測結(jié)果表明，對照組幼鼠在中央?yún)^(qū)活動時間顯著低于非中央?yún)^(qū)，而VPA處理組幼鼠在中央?yún)^(qū)與非中央?yún)^(qū)活動時間無顯著差異，這一活動方式與正常對照組幼鼠的活動方式存在明顯差異。U0126處理組幼鼠的活動方式與對照組幼鼠相比無顯著差異；而U0126聯(lián)合VPA處理組在中央?yún)^(qū)活動的時間則與VPA處理組相比顯著減少，活動方式明顯改變（圖2、表2）。

圖2 各組大鼠在中央?yún)^(qū)活動時間分析

2．2．2 U0126處理增加孤獨癥大鼠站立次數(shù) 檢測結(jié)果表明，與正常對照組幼鼠相比，VPA處理組幼鼠在5min之內(nèi)的站立次數(shù)顯著降低，而VPA聯(lián)合U0126處理組幼鼠的站立次數(shù)則比VPA處理組幼鼠明顯增加。見圖3、表3。

2．3 U0126處理抑制孤獨癥大鼠海馬、前額葉皮層和小腦組織的MEK／ERK信號通路 Western blot結(jié)果表明（圖4），與正常對照組相比，VPA處理組孤獨癥幼鼠的海馬、前額葉皮層與小腦組織中MEK／ERK信號通路中MEK與ERK蛋白的磷酸化水平顯著增強，而U0126處理組及VPA聯(lián)合U0126處理組中MEK與ERK蛋白的磷酸化水平明顯下降，表明U0126處理可抑制孤獨癥幼鼠前額葉皮層、海馬和小腦組織中的MEK／ERK信號通路。

表2 各處理組大鼠的中央?yún)^(qū)活動時間統(tǒng)計分析結(jié)果（x±s，min，n＝5）

圖3 各組大鼠站立次數(shù)分析

表3 各處理組大鼠的站立時間統(tǒng)計分析結(jié)果（x±s，min，n＝6）

圖4 Western blot分析各組大鼠前額葉皮層、海馬和小腦組織中MEK和ERK表達水平

3 討 論

社會交往實驗是檢測模型動物社會交往能力的有效實驗，檢測時，空籠子代表一種新事物，而陌生鼠代表新伙伴。通過分析被檢測鼠與空籠子及陌生鼠的接觸時間、自我梳理時間來判斷其社會交往能力的強弱［8］。本研究中VPA組模型幼鼠的社會交往能力與對照組相比明顯減弱，符合孤獨癥癥狀。在神經(jīng)行為學(xué)檢測實驗中，被檢測鼠在中央?yún)^(qū)所待時間的長短反映了其神經(jīng)興奮性，正常鼠具有避開中央?yún)^(qū)、在四周角落中探尋的習(xí)慣，而孤獨癥鼠則相對愿意待在中央?yún)^(qū)。站立次數(shù)則反映被檢測鼠在新環(huán)境中的探索能力。正常鼠通常探索能力強、站立次數(shù)多，而孤獨癥鼠則探索能力減弱、站立次數(shù)減少［8］。本研究中，VPA組孤獨癥模型鼠的站立次數(shù)與對照組相比明顯減少，表明其探索能力的減弱。VPA處理導(dǎo)致大鼠發(fā)生孤獨癥的相關(guān)機制尚不明確。本研究結(jié)果表明，VPA處理可以增加大鼠海馬、前額葉與小腦組織中ERK與MEK蛋白的磷酸化，從而強化了MEK／ERK信號通路，這與Yin等［5］在BTBR孤獨癥模型小鼠大腦皮質(zhì)中的發(fā)現(xiàn)相符，表明MEK／ERK信號通路的過度激活可能是孤獨癥發(fā)病的重要機制。

MEK與ERK是絲裂原化蛋白激酶家族（mitogen－aetivated protein kinases，MAPKs）成員，在神經(jīng)前體細胞的生成、神經(jīng)脊的發(fā)育和形成、突觸信號傳遞以及意識、學(xué)習(xí)和記憶能力形成過程中發(fā)揮重要作用［9］。近年來，大量研究證實 MEK／ERK信號通路異常是導(dǎo)致智力發(fā)育異常的重要分子機制。敲除ERK基因后會導(dǎo)致神經(jīng)干細胞的發(fā)育及成熟異常［10］，而MEK／ERK信號通路的過度激活則可能導(dǎo)致神經(jīng)細胞的凋亡［5］。本研究結(jié)果也進一步表明，孤獨癥模型大鼠腦組織中MEK／ERK通路被過度激活，而抑制這一信號通路則有助于改善孤獨癥的病癥行為。

U0126 （l，4－diamino－2，3－dieyano－l，4－bis［2－aminophenylthio］butadiene）是一種高度選擇性的MEK抑制劑，可特異地抑制 MEK／ERK通路活性［11］。U0126可阻斷氨酸或喜樹堿誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞損傷［12］，還可減輕谷氨酰胺缺乏引起的神經(jīng)細胞死亡及腦部外傷引起的海馬神經(jīng)損傷［13］。另外，多巴胺誘導(dǎo)的紋狀神經(jīng)元死亡也與 MEK／ERK通路活化有關(guān)［14］。但目前尚沒有U0126改善孤獨癥癥狀的相關(guān)報道。本實驗結(jié)果表明，U0126處理后大鼠前額葉皮質(zhì)、海馬及小腦組織中MEK與ERK蛋白磷酸化水平顯著下降，MEK／ERK信號通路被抑制，模型大鼠的孤獨癥病癥行為得到有效改善。因此，通過對MEK／ERK信號通路的抑制，U0126具有改善孤獨癥模型大鼠病癥行為的作用，這一結(jié)果為孤獨癥的治療提供了一定的理論與實驗依據(jù)。

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