c－cbl基因沉默對卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和侵襲的影響＊

付 沖，胡建國

（1．重慶市第五人民醫(yī)院婦產(chǎn)科 400062；2．重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 400010）

卵巢癌是發(fā)病率位居第2位的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，其病死率卻高居首位。卵巢癌早期診斷非常困難，臨床上發(fā)現(xiàn)時(shí)通常為中晚期。同時(shí)，由于卵巢癌的化療耐藥以及復(fù)發(fā)等因素，導(dǎo)致卵巢癌患者5年生存率較低。近年來，關(guān)于卵巢癌的起源產(chǎn)生了很多新的學(xué)說，如：腫瘤干細(xì)胞學(xué)說，卵巢癌二元論學(xué)說以及卵巢癌輸卵管起源學(xué)說等。這些都足以說明卵巢癌發(fā)生復(fù)雜，早期診斷困難。因此，有必要對卵巢癌進(jìn)一步研究［1］。c－cbl是CBL（the Casitas B－cell lymphoma）家族的2個(gè)重要成員。擁有連接體功能及E3泛素連接酶功能，其在表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）下調(diào)過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，c－cbl在胃癌、肺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌的增殖和遷移中發(fā)揮重要作用。但是，目前尚無在卵巢癌中的報(bào)道［2－5］。本文擬研究c－cbl蛋白在卵巢癌的表達(dá)及其功能。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)方法

1．1．1 免疫組織化學(xué)法 卵巢癌標(biāo)本組織芯片購買于西安艾麗娜生物科技有限公司。免疫組織化學(xué)法步驟按免疫組織化學(xué)S－P法試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）說明書操作：載玻片脫蠟、水化，然后在枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6．0；sigma公司）中運(yùn)用微波爐抗原修復(fù)20min，自然冷卻至室溫。PBS液洗3min×3次，3%H2O2室溫孵育15min，PBS液洗3min×3次，5%驢血清（ab7475，Abcam Company）37 ℃水浴30min，兔抗人c－cbl多克隆抗體（1∶100，ab32027，abcam 公司，美國）；4℃過夜，陰性對照用PBS代替一抗。37℃水浴2h，PBS液洗3min×3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記驢抗羊IgG（1∶300，bse－0294D，北京博奧森生物技術(shù)有限公司），PBS液洗3min×3次，辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）37℃水浴30min，PBS液洗3min×3次，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。陰性對照用PBS代替一抗。陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：所有切片的觀察經(jīng)3名病理科醫(yī)生獨(dú)立在光學(xué)顯微鏡下完成，每名病理科醫(yī)生選擇22個(gè)具有代表性的高倍視野（10×40倍），計(jì)數(shù)每個(gè)標(biāo)本陽性細(xì)胞數(shù)的比例。陽性結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)按照De Falco等［6］描述的方法判定并評分：0分（陽性細(xì)胞數(shù)小于1%）；1分（陽性細(xì)胞數(shù)占1%～20%）；2分（陽性細(xì)胞數(shù)占21%～40%）；3分（陽性細(xì)胞數(shù)占41%～60%）；4分（陽性細(xì)胞數(shù)超過61%）。所有值用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1．1．2 熒光定量PCR檢測c－cbl mRNA的表達(dá) 用Trozel（GIBCO）抽提細(xì)胞總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增c－cbl，并擴(kuò)增GAPDH作為內(nèi)參物，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RNA提取試劑購自廣州復(fù)能基因有限公司。c－cbl引物以及熒光定量PCR試劑盒購于廣州復(fù)能基因有限公司。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃10 min，95℃10s，60℃20s，72℃10s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。陰性對照以無RNA酶的水代替cDNA模板，每例樣品及對照均設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，取平均值。反應(yīng)結(jié)束后，由軟件自動得出熒光反應(yīng)曲線以及每個(gè)標(biāo)本反應(yīng)體系的擴(kuò)增效率（eficiency）及CT值，實(shí)驗(yàn)不同時(shí)間重復(fù)3次。

1．1．3 c－cbl siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成 以0．25%胰蛋白酶消化，用10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板，1．0×105細(xì)胞／孔，每孔100UL。當(dāng)細(xì)胞達(dá)30%～50%融合時(shí)用RNAmate轉(zhuǎn)染c－cbl siRNA，終濃度為5nM。轉(zhuǎn)染48h后，提取同一樣品總RNA和總蛋白。

1．1．4 EdU檢測細(xì)胞增殖 EdU購自廣州銳博生物科技有限公司。按照He等［7］步驟檢測。

1．1．5 細(xì)胞侵襲檢測 用24孔Boydem趨化小室（8m，Becton Dickinson），按照說明書方法進(jìn)行。收獲處理后72h后的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液懸浮，將0．2mL細(xì)胞懸液（1×10）加入上室，將含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液600 μL加入下室，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在37℃、以5%CO2條件下培養(yǎng)24h。取出膜，用棉簽去除上室底部未侵襲細(xì)胞，甲醇固定，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察侵襲至膜上的細(xì)胞，每孔計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野（×100）的細(xì)胞數(shù)。

1．1．6 P21和P53蛋白檢測 裂解組織以每孔25μg上樣，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，依次加入兔抗人P21和P53多克隆抗體（稀釋度1∶500），和辣根過氧化酶物標(biāo)記驢抗羊IgG，化學(xué)熒光發(fā)光法（ECL）顯影（碧云天公司），操作過程按說明書進(jìn)行。用凝膠成像系統(tǒng)成像，對結(jié)果進(jìn)行灰度掃描分析，相對表達(dá)量以P21和P53灰度面積積分分別與內(nèi)參的比值計(jì)算。

1．2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為正態(tài)分布，所有數(shù)據(jù)方差具有齊同性，兩組數(shù)據(jù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析，3個(gè)或者3組以上的采用one－way ANOVA分析，c－cbl和卵巢癌組織病理關(guān)系采用Mann－Whitney U檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 免疫組織化學(xué)法染色結(jié)果 c－cbl蛋白在卵巢癌組織腺癌、透明細(xì)胞癌、內(nèi)胚竇癌、顆粒細(xì)胞瘤、無性細(xì)胞瘤、卵泡膜瘤、轉(zhuǎn)移癌均呈陽性表達(dá)。在正常卵巢組織呈弱陽性或者不表達(dá)。c－cbl在卵巢上皮性癌組織表達(dá)評分和正常卵巢組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。c－cbl在晚期卵巢癌（Ⅲ／Ⅳ期）組織中表達(dá)比早期卵巢癌組織（Ⅰ／Ⅱ期）明顯增高。c－cbl在不同年齡患者的卵巢癌組織的表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），見圖1。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測c－cbl在卵巢癌組織的表達(dá)水平（×20）

2．2 熒光定量PCR結(jié)果 卵巢癌SKOV3細(xì)胞中，沉默c－cbl后，與對照組比較，c－cbl mRNA水平明顯下調(diào)（圖2）。

圖2 c－cbl siRNA轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞48h后，c－cbl mRNA和蛋白表達(dá)降低

2．3 Western blot檢測c－cbl、P21和 P53蛋白水平的表達(dá)情況 卵巢癌SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染c－cbl siRNA 48h后，Western blot結(jié)果顯示：與對照組比較，c－cbl蛋白水平下調(diào)，P21和P53蛋白水平上調(diào)（P＜0．05），見圖3。

2．4 沉默c－cbl后，卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖能力降低 轉(zhuǎn)染c－cbl siRNA 48h后，采用EdU標(biāo)記卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖能力。EdU濃度為10uM，加入卵巢癌SKOV3細(xì)胞中標(biāo)記4h。后續(xù)檢測步驟參照Salic等［8］。作者發(fā)現(xiàn)，卵巢癌SKOV3細(xì)胞中c－cbl基因沉默48h后，與對照組比較，細(xì)胞增殖率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見圖4。

2．5 卵巢癌SKOV3細(xì)胞沉默 c－cbl基因48h后，Transwell小室檢測卵巢癌細(xì)胞SKOV3侵襲能力，發(fā)現(xiàn)沉默c－cbl基因后，卵巢癌SKOV3細(xì)胞侵襲能力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見圖5。

圖3 SKOV3細(xì)胞沉默c－cbl后，c－cbl、P53和P21蛋白水平變化

圖5 Transwell檢測SKOV3細(xì)胞c－cbl基因沉默后的侵襲能力

3 討 論

表皮生長因子受體是erbB家族的成員之一，是一種170×103的膜受體蛋白，具有酪氨酸激酶活性。結(jié)合生長因子能夠活化細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，而受體本身則發(fā)生內(nèi)化及下調(diào)。c－cbl是CBL家族的重要成員，具有連接功能以及E3泛素連接酶功能，能夠靶向以EGFR為代表的一系列具有酪氨酸激酶活性的受體蛋白使之降解。在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。

自噬是細(xì)胞利用溶酶體消化受損細(xì)胞器及大分子物質(zhì)并為細(xì)胞提供能量的過程，被稱為“Ⅱ型程序性死亡”，其功能異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。卵巢癌起病隱匿，預(yù)后差，晚期卵巢癌5年生存率僅5%～15%［9］。有研究發(fā)現(xiàn)，自噬與卵巢癌的發(fā)生、預(yù)后及治療相關(guān)［10］。Beclin1等多種自噬相關(guān)基因在卵巢癌中表達(dá)下調(diào)，高表達(dá)自噬相關(guān)蛋白PEA－15的卵巢癌患者生存期更長，有望成為卵巢癌新的預(yù)后指標(biāo)［11］。有研究發(fā)現(xiàn)，CBL擁有一個(gè)LIR結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域可以和自噬蛋白LC3相互作用，并且CBL可以作為SRC的受體從而調(diào)控自噬［12］。

作者研究發(fā)現(xiàn)，c－cbl蛋白主要表達(dá)于卵巢癌組織的細(xì)胞質(zhì)。在卵巢癌不同組織來源，包括卵巢腺癌、透明細(xì)胞癌、內(nèi)胚竇癌、顆粒細(xì)胞瘤、無性細(xì)胞瘤、卵泡膜瘤、轉(zhuǎn)移癌均呈陽性表達(dá)。在正常卵巢組織呈弱陽性或者不表達(dá)。同時(shí)，作者體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，卵巢癌SKOV3細(xì)胞沉默c－cbl基因后，SKOV3細(xì)胞侵襲能力和增殖能力均降低，說明c－cbl蛋白在卵巢癌過表達(dá)有利于卵巢癌的生長和侵襲。在胃癌當(dāng)中，c－cbl的高表達(dá)與胃癌的侵襲和發(fā)展有關(guān)，c－cbl有可能成為胃癌新的分子標(biāo)志物［13］。因此，作者推測，c－cbl蛋白在卵巢癌中高表達(dá)和卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，有可能成為一個(gè)新的標(biāo)志物。

P21基因是細(xì)胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑家族中的重要成員。一方面，P21與腫瘤抑制作用相關(guān)，同時(shí)又能通過抑制周期素依賴激酶復(fù)合物活性，調(diào)整細(xì)胞周期、DNA復(fù)制與修復(fù)之間的關(guān)系。進(jìn)而將腫瘤抑制作用與細(xì)胞周期控制過程聯(lián)系起來。P21基因的發(fā)現(xiàn)、克隆及其在細(xì)胞周期控制與腫瘤發(fā)生中有重要作用［14］。近年研究發(fā)現(xiàn)，P53是一種腫瘤抑制基因，其基因編碼的蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄因子，控制著細(xì)胞周期的啟動。和其他腫瘤抑制基因一樣，P53基因在正常情況下對細(xì)胞分裂起著減慢或監(jiān)視的作用。在細(xì)胞周期中，P53的調(diào)節(jié)功能主要體現(xiàn)在G1和G2／M期校正點(diǎn)的監(jiān)測，與轉(zhuǎn)錄激活作用密切相關(guān)。P53基因下游基因P21編碼蛋白是一個(gè)依賴Cyclin的蛋白激酶抑制劑。P21可與一系列Cyclin－cdk復(fù)合物結(jié)合，抑制對應(yīng)的蛋白激酶活性，引起Cyclin－cdk無法磷酸化Rb，非磷酸化狀態(tài)的Rb保持與E2F的結(jié)合，導(dǎo)致E2F這一轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子不能活化，引起G1期阻滯［15］。作者研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌SKOV3細(xì)胞沉默c－cbl后，P21和P53蛋白表達(dá)上調(diào)。提示c－cbl調(diào)控SKOV3細(xì)胞周期和增殖可能通過調(diào)控P21和P53蛋白引起。

綜上所述，自噬調(diào)控基因c－cbl在卵巢癌組織表達(dá)增高，沉默c－cbl基因引起卵巢癌增殖能力和侵襲能力降低。c－cbl可能作為卵巢癌治療的一個(gè)靶點(diǎn)或者早期診斷的標(biāo)志物。后續(xù)將繼續(xù)深入研究c－cbl在卵巢癌中的作用機(jī)制。

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