腸上皮細(xì)胞緊密連接的研究進(jìn)展

張金衛(wèi) 林漢杰 韓凌

[摘要] 腸上皮細(xì)胞緊密連接（TJ）在腸道黏膜屏障中起著重要作用，其受損會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間的通透性增加，細(xì)菌、內(nèi)毒素和大分子物質(zhì)通過細(xì)胞旁路途徑進(jìn)入其他組織、器官或體循環(huán)，從而引發(fā)疾病。本文從蛋白角度和信號(hào)通路角度介紹腸上皮細(xì)胞TJ的研究進(jìn)展，并進(jìn)一步指出腸黏膜受到刺激后分泌大量的Zonulin蛋白，其與Zonulin受體結(jié)合，傳導(dǎo)信號(hào)，調(diào)控TJ上Claudin、Occludin、JAM、ZOs、Cingulin等多種蛋白的表達(dá)，從而開放TJ。腫瘤壞死因子-α通過激活核轉(zhuǎn)錄因子κB p65/p50異源二聚體與啟動(dòng)子下游κB結(jié)合區(qū)域結(jié)合激活肌球蛋白輕鏈激酶轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子是TJ信號(hào)通路中較為成熟的通路。

[關(guān)鍵詞] 緊密連接；腸上皮細(xì)胞；信號(hào)通路

[中圖分類號(hào)] R574.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）02（c）-0160-04

腸屏障是指腸道能夠防止腸內(nèi)有害物質(zhì)穿過腸黏膜進(jìn)入其他組織、器官和血液循環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能的總和。腸屏障由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障和生物屏障共同構(gòu)成，其中機(jī)械屏障最為重要。機(jī)械屏障由腸上皮細(xì)胞及其連接構(gòu)成，調(diào)控著水和溶質(zhì)的跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)。腸上皮細(xì)胞間的連接包括緊密連接（tightjunction，TJ）、縫隙連接（gapjunction，GJ）、黏附連接（adhesion junction，AJ）及橋粒（desmosome）等，其中，TJ在腸屏障中發(fā)揮著重要作用。在透射電鏡下觀察，TJ位于上皮細(xì)胞頂端，呈箍狀圍繞在細(xì)胞的周圍，線條清晰連續(xù)，邊緣光滑流暢，可與下段復(fù)合連接勾勒出纖毛柱狀上皮細(xì)胞的柱狀形態(tài)。TJ由50多種蛋白組成，分為結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成TJ的結(jié)構(gòu)骨架；功能蛋白連接細(xì)胞骨架及膜蛋白，并傳遞信號(hào)[1]。TJ一方面調(diào)控著細(xì)胞的通透性，另一方面作為信號(hào)中心在細(xì)胞外環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)之間進(jìn)行著雙向信息傳遞，調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長(zhǎng)以及細(xì)胞的極性、表型和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[2]。在生理情況下，離子及小分子物質(zhì)能夠通過TJ，毒性大分子和微生物則不能通過。如果TJ受損，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞通透性增加，細(xì)菌、內(nèi)毒素和大分子物質(zhì)通過旁路途徑進(jìn)入其他組織、器官或體循環(huán)，從而引發(fā)多種疾病，例如炎癥性腸病、腹瀉、乳糜瀉、食物過敏等。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外主要從蛋白角度和信息通路角度研究腸上皮細(xì)胞TJ，本文主從這兩個(gè)角度介紹其研究進(jìn)展。

1 從蛋白角度研究腸上皮細(xì)胞TJ現(xiàn)狀

腸上皮細(xì)胞TJ由50多種蛋白組成，分為結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白主要有Occludin、Claudin和JAM等，構(gòu)成TJ的結(jié)構(gòu)骨架；功能蛋白主要有ZO-1、ZO-2、ZO-3、Cingulin和Zonulin等，連接細(xì)胞骨架及膜蛋白，并傳遞信號(hào)[1]。目前，國(guó)內(nèi)外研究的焦點(diǎn)是Occludin、Claudin、ZOs和Zonulin。

1.1 Occludin蛋白

Occludin蛋白是在TJ中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的蛋白，其為4分子交聯(lián)體蛋白，2個(gè)環(huán)分布在細(xì)胞外，N端和C端分布在細(xì)胞內(nèi)，相對(duì)分子量為65 000[3]。Occludin蛋白是TJ的主要組成部分，其4次跨膜結(jié)構(gòu)能夠和Claudin-l、Claudin-2及其他外周膜蛋白結(jié)合[4]，對(duì)維持TJ的結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義[5]。研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥性腸病中，腸黏膜Occludin蛋白表達(dá)水平下降[6]。Occludin蛋白可增強(qiáng)成纖維細(xì)胞間的黏附性，增加跨膜電阻[7]，調(diào)節(jié)細(xì)胞間的通透性[8]。乳酸桿菌等益生菌干預(yù)大腸埃希菌（E. coli）感染的小腸上皮細(xì)胞，使Occludin蛋白和細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)升高，從而修復(fù)了破壞的TJ[9]。研究表明，腸致病菌及其毒素通過下調(diào)Occludin蛋白表達(dá)的途徑破壞TJ結(jié)構(gòu)[10]。

1.2 Claudin蛋白

Claudin蛋白家族對(duì)TJ結(jié)構(gòu)起到支柱作用[11]。Claudin蛋白參與了TJ上只允許離子和小分子物質(zhì)通過的小“孔”的形成[8]。缺少Claudin-1的小鼠在出生數(shù)小時(shí)內(nèi)因脫水而死亡，研究表明，表皮屏障因缺少Claudin-1而導(dǎo)致功能失常，水分由皮膚大量流失，進(jìn)而引發(fā)小鼠死亡[12]。細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論[13]。實(shí)驗(yàn)表明，缺少Claudin-1表達(dá)會(huì)使腸道屏障受損[14]。楊麗等[15]用應(yīng)激因子腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（corticotrophin-releasingfactor，CRF）誘導(dǎo)了腸上皮細(xì)胞TJ相關(guān)蛋白Claudin-2表達(dá)升高，并且發(fā)現(xiàn)這種誘導(dǎo)作用與核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）激活有關(guān)。

1.3 ZOs蛋白

ZOs是外周膜蛋白，能夠與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Occludin蛋白的末端連接，與Occludin蛋白、肌動(dòng)蛋白骨架構(gòu)成穩(wěn)定的連接系統(tǒng)[16]。ZO-1是連接跨膜蛋白Occludin、Claudin-5與細(xì)胞骨架蛋白F-actin的橋梁蛋白，其分布和表達(dá)影響著TJ的結(jié)構(gòu)和功能[17]。孫兆瑞等[16]發(fā)現(xiàn)，ZO-1和Occludin主要定位在細(xì)胞膜上，呈邊緣平滑的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。Al-Sadi等[8]用肺炎克雷伯菌、乳酸桿菌、糞腸球菌和大腸埃希菌刺激Caco-2細(xì)胞，降低了TJ中ZO-1的表達(dá)。

1.4 Zonulin蛋白

Zonulin蛋白是最近發(fā)現(xiàn)的可調(diào)節(jié)腸道通透性的生理性蛋白，能夠快速并且可逆的調(diào)控TJ[18]。Fasano[19]發(fā)現(xiàn)，腸黏膜受到細(xì)菌或麥膠蛋白刺激后分泌大量的Zonulin蛋白，其與Zonulin受體結(jié)合，傳導(dǎo)信號(hào)，開放TJ，從而增加細(xì)胞的通透性。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，沙門菌和3種類型的大腸埃希菌都能夠誘導(dǎo)Zonulin的釋放、ZO-1蛋白重布和細(xì)胞通透性的增加[20]。另外，臨床試驗(yàn)證明，口服益生菌能夠降低血清中Zonulin的含量，進(jìn)而有效地預(yù)防相關(guān)感染[21]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，糖尿病傾向大鼠腸腔內(nèi)的Zonulin含量升高，阻斷Zonulin受體能夠降低糖尿病的發(fā)病率[22]。雖然腸道分泌過量的Zonulin蛋白會(huì)導(dǎo)致屏障受損，但是，生理情況下，Zonulin蛋白構(gòu)成了機(jī)體的固有免疫[23]。腸上皮細(xì)胞受到腸內(nèi)細(xì)菌的刺激后，釋放Zonulin蛋白，開放TJ，增加腸腔內(nèi)液體的分泌，從而有效地阻止小腸遠(yuǎn)端細(xì)菌向近端的定植[20]，起到了免疫調(diào)節(jié)的作用。

2 從信號(hào)通路角度研究腸上皮細(xì)胞TJ現(xiàn)狀

腸上皮細(xì)胞TJ一方面調(diào)控著細(xì)胞的通透性，另一方面作為信號(hào)中心在細(xì)胞外環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)之間進(jìn)行著雙向信息傳遞，調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長(zhǎng)以及細(xì)胞的極性、表型和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[2]。在眾多腸上皮細(xì)胞TJ信號(hào)通路中，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）/NF-κB/肌球蛋白輕鏈激酶（myosin lightchain kinase，MLCK）信號(hào)通路較為成熟。

2.1 信號(hào)通路概論

MLCK、磷脂酰肌醇三磷酸激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol three kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、絲裂原活化的蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）、非受體蛋白酪氨酸激酶（non receptor protein tyrosine kinase，NRPTK）、Rho/Rho激酶（Rho/Rho associated kinase，ROCK）和蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）等信號(hào)通路調(diào)控著TJ蛋白的表達(dá)[24]。這些信號(hào)通路調(diào)控著TJ蛋白的組裝、分解和磷酸化，影響著其構(gòu)象和生物化學(xué)特性，調(diào)節(jié)著TJ的開放，其中，PI3K/AKT、MAPK和PKC信號(hào)通路在調(diào)控TJ蛋白表達(dá)及其磷酸化過程中發(fā)揮著重要作用[24]。徐焰等[25]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellularsignal-regulated kinase，ERK1/2）和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（protein kinase B，AKT）的抑制劑可部分回轉(zhuǎn)鉛誘導(dǎo)的緊密連接ZO-1蛋白、Pccludin蛋白和Claudin-5蛋白的下降。

2.2 TNF-α/NF-κB/MLCK信號(hào)通路

MLCK是Ca2+/鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）依賴蛋白激酶家族的一員。Ca2+/CaM復(fù)合體是MLCK的重要元件[26]，其與MLCK結(jié)合后，解離MLCK的天然抑制物[27]，激活MLCK，形成MLCK前體。激活的MLCK使肌球蛋白輕鏈（myosin lightchain，MLC）的Thr18及Ser19磷酸化[28]，改變MLC的空間構(gòu)象[29]。同時(shí)，增強(qiáng)肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白絲之間的相互作用[30]，使肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白絲收縮，增加TJ和細(xì)胞表面的張力，最終調(diào)控細(xì)胞骨架，開放TJ[31]。MLCK的活性決定著MLC磷酸化的程度[28]，而在調(diào)控細(xì)胞骨架和細(xì)胞收縮等過程中MLC的磷酸化又起著舉足輕重的作用[32]。研究進(jìn)一步證明，MLC的磷酸化在TJ受損的過程中起著重要作用，肌動(dòng)蛋白解聚劑能夠開放TJ[33]。Zolotarevsk等[34]發(fā)現(xiàn)，MLC的磷酸化啟動(dòng)了TJ的開放。Shen等[35]證明了，在維護(hù)TJ結(jié)構(gòu)及其功能的完整性過程中，MLCK發(fā)揮著重要作用。敲除MLCK基因或使用MLCK抑制劑都能夠減輕TJ的損傷，這提示著MLCK在TJ調(diào)控中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[36]。

TNF-α具有激活MLCK活性、促進(jìn)MLC磷酸酶轉(zhuǎn)錄、上調(diào)MLCK蛋白的作用，其影響著MLC的磷酸化及TJ蛋白的表達(dá)，動(dòng)態(tài)調(diào)控著TJ的結(jié)構(gòu)[37]。韓亮等[38]證實(shí)，抗TNF-α抗體通過抑制小腸黏膜上皮細(xì)胞的MLCK表達(dá)及其活性的途徑修復(fù)受損的TJ。

Ma等[39]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α誘導(dǎo)的TJ相關(guān)蛋白表達(dá)異常、細(xì)胞通透性升高與NF-κB的激活有關(guān)，并進(jìn)一步證實(shí)了TNF-α引起MLCK轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的激活，是由于NF-κBp65/p50異源二聚體與啟動(dòng)子下游κB結(jié)合區(qū)域結(jié)合引起的。

3 小結(jié)與展望

從蛋白角度研究腸上皮細(xì)胞TJ中Zonulin、Claudin、Occludin、JAM、ZOs和Cingulin等成為熱點(diǎn)，然而，本文發(fā)現(xiàn)，Zonulin蛋白與其余蛋白的表達(dá)具有一致性，基于這一點(diǎn)，筆者提出：腸黏膜受到刺激后分泌大量的Zonulin蛋白，其與Zonulin受體結(jié)合，傳導(dǎo)信號(hào)，調(diào)控TJ上Claudin、Occludin、JAM、ZOs和Cingulin等多種蛋白的表達(dá)，從而開放TJ。

從信號(hào)通路角度研究腸上皮細(xì)胞TJ中，多數(shù)是基于蛋白表達(dá)來(lái)證明的，鮮有從基因水平論證的，例如，Clayburgh等[36]敲除MLCK基因。從基因水平論證相關(guān)信號(hào)通路是最直接、最有力的證據(jù)，筆者認(rèn)為從基因水平論證相關(guān)信號(hào)通路是今后的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，并指出TNF-α通過激活NF-κB p65/p50異源二聚體與啟動(dòng)子下游κB結(jié)合區(qū)域結(jié)合激活MLCK轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子是TJ信號(hào)通路中較為成熟的通路。

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