基于nad5的西施舌漳州群體遺傳分化水平分析
——以蛤蜊屬2個物種差異水平為參照

孟學(xué)平， 申 欣，屠海淼，朱笑琳， 趙娜娜,2， 程漢良，閻斌論

1 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院, 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 連云港 222005 2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 江蘇省海洋生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210095

基于nad5的西施舌漳州群體遺傳分化水平分析
——以蛤蜊屬2個物種差異水平為參照

孟學(xué)平1,*， 申 欣1，屠海淼1，朱笑琳1， 趙娜娜1,2， 程漢良1，閻斌論1

1 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院, 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 連云港 222005 2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 江蘇省海洋生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210095

擴(kuò)增了西施舌日照、連云港、北海、漳州4個野生群體、四角蛤蜊和中國蛤蜊各1個群體共73個樣本的NAD5基因片段，測序獲得了480bp核苷酸序列，分析核苷酸的多態(tài)性，旨在評估福建漳州西施舌與日照、連云港、北海西施舌之間的分化水平。結(jié)果：從73個序列中共檢測到44種單倍型(Hap)，其中西施舌4個群體有29種Haps，四角蛤蜊和中國蛤蜊分別有10種和5種Haps，漳州群體與北海、日照、連云港群體單倍型有明顯差異；將西施舌分為北海、日照、連云港組(GP1)和漳州組(GP2)2個組，分析核苷酸差異，GP1與GP2間的T、A、G含量差異極顯著(P<0.01)。GP1與GP2間的遺傳距離與組內(nèi)(GP1、GP2)遺傳距離之比為25.1—41.8，四角蛤蜊與中國蛤蜊之間的遺傳距離與種內(nèi)個體間遺傳距離之比為24.4—36.7，GP1、GP2間的差異達(dá)到了四角蛤蜊和中國蛤蜊種間差異水平，而日照、北海群體間的遺傳距離只有0.009，北海與日照群體地理位置雖遠(yuǎn)，但遺傳差異則很小；AMOVA分析顯示漳州西施舌發(fā)生了極顯著遺傳分化(FST=0.966—0.978,P<0.01)。

西施舌; 四角蛤蜊; 中國蛤蜊;nad5; 差異

西施舌廣泛地分布于中國沿海，北至遼寧大連，南到廣西北海，20年前，福建西施舌產(chǎn)量最多。西施舌是一種珍奇的重要漁業(yè)資源，在我國已屬于瀕危物種[1]。來自形態(tài)學(xué)[1-2]、核DNA[3]和線粒體基因組部分序列[4-6]等分子生物學(xué)的資料均顯示中國福建(漳州、長樂)西施舌發(fā)生了明顯的分化，是西施舌的亞種或隱種；來自線粒體全基因組的比較基因組學(xué)資料也顯示漳州西施舌與日照西施舌發(fā)生了明顯的分化，使其與其它群體的差異達(dá)到了亞種或種間差異水平[7-9]。目前的資料為福建西施舌分類地位的重新確定提供了重要的依據(jù)，但是，就現(xiàn)有的研究結(jié)果，要確定福建西施舌是西施舌的亞種或腔蛤蜊屬(Coelomactra)的新種，資料尚顯不足。線粒體DNA編碼的基因保守性不同，在群體遺傳差異分析中的解析力也不同。NADH脫氫酶亞基5基因(nad5)在雙殼類中相對保守，但較核糖體16S rRNA基因(16SrRNA)、細(xì)胞色素c氧化酶亞基1基因(cox1)變異稍大，更能顯示群體變異水平。本研究基于nad5核苷酸序列分析中國西施舌4個代表性自然群體遺傳差異，同時以蛤蜊科(Mactridae)蛤蜊屬(Mactra)的中國蛤蜊(Mactrachinesis)和四角蛤蜊(Mactraveneriformis)間、雙殼類部分屬屬內(nèi)不同物種間nad5差異水平為參照，對福建西施舌分化水平的界定可提供更有說服力的證據(jù)，研究結(jié)果對西施舌種質(zhì)資源的保護(hù)和可持續(xù)利用及良種選育具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用樣本73個，其中西施舌55個，分別采自福建漳州(14個)、連云港(9個)、山東日照(20個)和廣西北海(12個)沿海；中國蛤蜊(8個)采自山東日照；四角蛤蜊(10個)采自江蘇連云港海域。樣本經(jīng)鑒定后，取閉殼肌75%乙醇固定備用，或用新鮮組織直接提取DNA。

1.2 DNA提取及PCR擴(kuò)增

取乙醇保存的或新鮮組織，用SDS、蛋白酶K裂解組織，用酚-氯仿法抽提蛋白質(zhì)，乙醇沉淀獲得總DNA。將日照[9]、漳州西施舌、中國蛤蜊和四角蛤蜊nad5核苷酸序列用Clustalx軟件進(jìn)行比對，根據(jù)相對保守區(qū)，設(shè)計(jì)兼并引物，Thm-4S-ND5F： GRG AGT CNT AYT CYG CTG G：Thm-4S-ND5R：TGA ACR CCV CCW CTR CAM GC。PCR體系25 μL，模板20—50 ng，dNTP(10 mmol/dm3each)0.5 μL，Taq DNA聚合酶 [D0090，生工生物工程(上海)股份有限公司(上海生工)] 0.3 μL(5U/μL)，95℃預(yù)變性5 min后，進(jìn)行35個循環(huán)擴(kuò)增：94℃變性45 s，52—55 ℃退火30 s，72℃延伸1 min。循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸10 min。

1.3 PCR產(chǎn)物測序及序列比對分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送上海生工進(jìn)行雙向測序。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收，在ABI公司的3730xl DNA Analyzer測序儀上測序，試劑為BigDye terminator v3.1。

利用DNAStar軟件包中的SeqMan軟件對序列進(jìn)行組裝拼接，用看圖軟件Chromas分析測序峰圖，用人工的方法對序列進(jìn)行校對；查找、切除引物序列，獲得用于比對分析的nad5片段核苷酸序列；用SPSS 17.0進(jìn)行堿基含量差異顯著性分析；用DnaSP v5.1軟件進(jìn)行單倍型確定；用Clustalx進(jìn)行序列對位排列，MEGA4.0進(jìn)行核苷酸序列差異分析：統(tǒng)計(jì)變異位點(diǎn)、簡約信息位點(diǎn)，根據(jù)K2-P (Kimura 2-parameter)計(jì)算遺傳距離，用鄰接法(Neighber-Joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)樹節(jié)點(diǎn)處自舉置信水平用bootstrap估計(jì)，驗(yàn)證次數(shù)設(shè)置為1000；用Arlequin ver 3.1進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)，群體間遺傳分化指數(shù)(FST)計(jì)算采用pairwise difference模型。

1.4 雙殼類4個屬屬內(nèi)種間遺傳距離分析

從GenBank下載雙殼類(Bivalve)巨蠣屬(Crassostrea)8個種、貽貝屬(Mytilus)4個種、竹蟶屬(Solen)2個種、文蛤?qū)?Meretrix)2個種線粒體全基因組，從中析出nad5全序列，截取與本研究擴(kuò)增序列的同源部分，計(jì)算屬內(nèi)種間的遺傳距離(K2-P)，作為漳州西施舌與非漳州西施舌差異水平判斷的參照。物種拉丁文、GenBank序列號見表5及本文討論部分。

2 結(jié)果

2.1nad5序列核苷酸含量差異分析

本研究共獲得西施舌日照、連云港、北海、漳州群體，中國蛤蜊日照群體、四角蛤蜊連云港群體nad5序列73條，拼接后去除引物序列、兩端取齊后得到480 bp的DNA片段，用于序列比對與分析。

西施舌4個群體共55條nad5片段，各群體nad5 堿基T、C、A、G平均含量(%)如表1，由表1可見漳州西施舌堿基T和A的含量極顯著低于其它3個群體(P<0.01)，G含量顯著高于其它3個群體，C含量4個群體差異不顯著。而北海、日照和連云港群體間4種堿基含量差異均不顯著(P>0.05)。四角蛤蜊/中國蛤蜊共18條序列，其T、C、A、G平均含量(%)分別為46.27/42.24、13.94/15.68、20.65/20.86、19.15/21.22，AT含量為66.92/63.10，其中T、A和G含量(%)差異極顯著(P<0.01)，A含量差異不顯著(P>0.05)。

表1 西施舌4個群體nad5核苷酸差異分析Table 1 Nucleotide differentiation analysis on nad5 of Coelomactra antiquata four populations

小寫字母表示在0.05水平上差異顯著；大寫字母表示在0.01水平上差異顯著

2.2 序列比較分析

序列經(jīng)DnaSP分析，從73個序列中共檢測到44種單倍型(Hap) (表2)，其中西施舌有29種Haps，四角蛤蜊10種，中國蛤蜊5種；西施舌中，漳州群體有5種Haps，日照群體15種，連云港群體8種，北海群體3種。其中Hap2由連云港群體和北海群體共享，Hap21由連云港群體和日照群體共享，漳州群體與其它3個群體無共享單倍型。44種Haps序列比對共獲得480個比對位點(diǎn)，無插入/缺失堿基，西施舌4個群體29個Haps變異位點(diǎn)(V)122個，占25.4%，簡約信息位點(diǎn)(Pi)108個(圖1)，占22.5%，北海、日照、連云港群體合并計(jì)算，V 位點(diǎn)39 個，占8.1%，Pi 位點(diǎn)14 個，占2.9%；中國蛤蜊和四角蛤蜊共有V 位點(diǎn)99 個，占20.6%，Pi 位點(diǎn)91 個(圖1)，占19.0%；3 種貝類合并計(jì)算，V 位點(diǎn) 197 個，Pi 位點(diǎn)191 個，分別占41.0%和39.8%。

圖1 蛤蜊科3種貝類NAD5基因片段核苷酸序列簡約信息位點(diǎn)比對Fig.1 NAD5 gene fragments comparision of three species in family Mactridae Hap: 單倍型; Hap4—8: 漳州群體; Hap9—23: 日照群體; Hap1—3: 北海群體;Hap2, 21, 24—29: 連云港群體; Hap30—39:四角蛤蜊群體; Hap40—44：中國蛤蜊群體

2.3 基于nad5片段的遺傳距離

將44種Haps分為4組，日照、連云港、北海群體分為一組(Gp1)，漳州群體分為另一組(Gp2)，四角蛤蜊群體(Gp3)、中國蛤蜊群體(Gp4)各分為一組，計(jì)算組內(nèi)和組間遺傳距離(K2-P)。Gp2組內(nèi)遺傳距離(D)平均為0.006；Gp1組內(nèi)D值平均為0.010；Gp3組內(nèi)D值平均為0.009，Gp4組內(nèi)D值平均為0.006。Gp1和Gp2間的D值為0.250—0.251，Gp3和Gp4間的D值為0.220，Gp1、Gp2與Gp3、Gp4之間的D值在0.304—0.365之間。計(jì)算Gp1、Gp2間的遺傳距離(BG)與Gp1、Gp2組內(nèi)遺傳距離(WG)的比值(BG/WG)，結(jié)果顯示BG/WG值為25.1—41.8，Gp3、Gp4間的BG/BW比值為24.4—36.7(表3)。日照與北海群體間的遺傳距離只有0.009，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于漳州與其它群體的遺傳距離。西施舌漳州群體和非漳州群體的BG/BW值在四角蛤蜊和中國蛤蜊的BG/BW比值范圍內(nèi)，說明西施舌漳州群體與日照、連云港、北海群體間的差異達(dá)到種間差異的水平。

表2 蛤蜊科3種貝類 nad5片段單倍型Table 2 The haplotypes on nad5 fragments of Mactridae three species

pop.: population, Hap: haplotype；ZZ：漳州，RZ：日照，LYG：連云港；BH：北海；Mve：四角蛤蜊，Mch：中國蛤蜊

表3 基于nad5片段核苷到的遺傳距離Table 3 Genetic distances based on nad5 nucleotide

BG、WP：組間、組內(nèi)遺傳距離(between groups, within group genetic distances)，BG/WG：組間與組內(nèi)遺傳距離比值(the ratio of BG/WG)； Gp(group):組，A：Gp1與Gp2間，B:Gp3與Gp4間

2.4 群體遺傳差異的分子方差分析(AMOVA)

用AMOVA方法分析西施舌組間、群體間和群體內(nèi)遺傳變異來源，結(jié)果顯示(表4)，95.55%的變異來源于組間，即漳州組與混合組(連云港、日照、北海)間，說明組間群體遺傳分化很大，3.56%的變異來源于群體內(nèi)，只有0.89%的變異來源于組內(nèi)群體間，提示西施舌漳州群體發(fā)生了極大的遺傳分化。漳州群體與日照、連云港和北海群體間的FST分別為0.967(P<0.01)、0.963(P<0.001)和0.976(P<0.01)，說明漳州西施舌與日照、連云港和北海群體遺傳分化很大，而北海與日照、北海與連云港間的FST分別為0.258(P<0.01)和0.191(P<0.01)，日照與連云港群體間的FST為0.013(P>0.05)，這兩個群體間的遺傳分化很小，兩組間的FST為0.964(P<0.01),四角蛤蜊與中國蛤蜊間的FST為0.965(P<0.01)。

表4 西施舌種群差異分子方差分析(AMOVA)Table 4 The AMOVA analysis of Coelomactra antiquata genetic difference

2.5 基于nad5的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖2 基于nad5的蛤蜊科3種貝類的NJ樹 Fig.2 The NJ tree based on nad5 of three species in family Mactridae A支：西施舌4個群體，B支：四角蛤蜊、中國蛤蜊各1個群體，Hap: 單倍型

基于nad5的 44種單倍型構(gòu)建了西施舌不同群體與四角蛤蜊、中國蛤蜊的系統(tǒng)發(fā)生NJ樹(圖2)，由圖2可見，進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)形成2大支(A支，B支)，A支又分為2小支(A-1，A-2)，B也分為2小支(B-1，B-2)。日照、連云港、北海群體不同的單倍型交叉聚為支持率(100%)較高的一小支(A-2)，漳州群體不同單倍型聚為另一小支(A-1)(100%)。中國蛤蜊、四角蛤蜊不同單倍型分別聚為兩小支(B-1和B-2)(100%)。圖2可見，漳州西施舌與日照、連云港、北海西施舌相聚，形成清晰的兩支，說明漳州西施舌與日照、連云港、北海西施舌發(fā)生了明顯的分化。

3 討論

本人對日照、漳州西施舌線粒體全基因組組成及結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較[7]，發(fā)現(xiàn)兩地西施舌tRNAs組成、非編碼區(qū)組成有明顯差異，但是線粒體基因組結(jié)構(gòu)只反映了2個個體間的差異，是否一個群體中其它不同的個體間的差異也達(dá)到如此高的水平，需要對更多的線粒體全基因組進(jìn)行比對，但全基因組測序耗資頗大，為了能達(dá)到既經(jīng)濟(jì)、又能獲得大量有效信息資料，因此，決定擴(kuò)大取樣量，將線粒體基因組個別基因或非編碼區(qū)序列進(jìn)行比較。本人前期工作中及國內(nèi)其它學(xué)者對線粒體DNA的16SrRNA和cox1、細(xì)胞色素b基因(cob)進(jìn)行了群體間的比對。線粒體DNA編碼的基因中，16SrRNA和cox1常被用來進(jìn)行高[10]、低[11]階元種類群體差異分析。nad5核苷酸較16S和cox1變異稍大，用于遺傳差異分析相對靈敏，此外，nad5分子量相對大，便于設(shè)計(jì)引物，因此，本研究選擇了nad5作為標(biāo)記，可放大差異，便于觀察。目前，關(guān)于群體基因核苷酸差異值的種間、種內(nèi)差異界限尚無標(biāo)準(zhǔn)，且不同的動物的相同基因保守性不同，因此，也不便定標(biāo)準(zhǔn)。但對于同一個基因的種間差異與種內(nèi)個體間差異之比值相對穩(wěn)定，可作為重要的參考指標(biāo)。Hebert[12-13]提出了10×規(guī)則：認(rèn)為cox1在群體間的差異若是群體內(nèi)差異的10倍以上，則認(rèn)為兩群體可能是2個種。前期工作中基于cox1的福建群體與非福建群體間的差異與福建群體內(nèi)或非福建群體內(nèi)的差異之比為17.8—23.5，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于10?；趎ad5基因種間差異界限目前尚不明確，本研究基于nad5的漳州群體與非漳州群體間的差異與群體內(nèi)個體間的差異之比為25.1—41.8，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于10。若參考基于cox1的10×規(guī)則，此差異也達(dá)到種間差異水平。為了有一個可參考的值，本研究計(jì)算了與西施舌同一個科(Mactridae)的蛤蜊屬(Mactra)中國蛤蜊和四角蛤蜊間的差異與群體內(nèi)差異比值(24.4—36.7)，此比值與漳州群體、非漳州群體間與群體內(nèi)之比值相似，nad5資料證明漳州西施舌已經(jīng)分化為一個新種。

本研究基于nad5片段(與本研究采用的西施舌nad5片段同源)分析了雙殼類巨蠣屬、貽貝屬、文蛤?qū)佟⒅裣|屬4個屬屬內(nèi)種間遺傳距離(D)(K2-P)，結(jié)果顯示巨蠣屬8個物種間的D值為0.053—0.379，多數(shù)在0.150—0.269之間(表5)。貽貝屬4個物種間的D值為0.011—0.317，多數(shù)在0.218—0.291之間(表5)。竹蟶屬的大竹蟶(Solengrandis，NC_016665)和長竹蟶(Solenstrictus，NC_017616)之間的D值為0.210。文蛤?qū)俚闹腥A文蛤(Meretrixpetechialis，NC_012767)和麗文蛤(MeretrixlusoriaNC_014809)間的遺傳距離為0.090。而西施舌混合群體(北海、日照和連云港)與漳州群體間的遺傳距離為0.250—0.251(表3)，此值在巨蠣屬8種貝類、貽貝屬4種貝類種間遺傳距離范圍內(nèi)；大于文蛤?qū)?種貝類、竹蟶屬2種貝類間的遺傳距離，這從側(cè)面證明西施舌漳州群體與其它3個群體的差異達(dá)到了種間差異水平。

西施舌連云港與北海群體、連云港與日照群體間均有共享nad5單倍型，說明3個群體間有基因交流現(xiàn)象，但漳州群體與上述3個群體間無共享單倍型，說明無基因交流現(xiàn)象，存在生殖隔離，其原因有待進(jìn)一步研究；本研究分析了群體間nad5核苷酸組成差異顯著性，發(fā)現(xiàn)西施舌漳州與非漳州群體的T、A、G 3種核苷酸含量差異極顯著(P<0.01)，而中國蛤蜊與四角蛤蜊的也有 3種核苷酸(T、C、G)含量差異極顯著(P<0.01)；AMOVA分析結(jié)果顯示西施舌漳州群體與非漳州群體的FST=0.964，而中國蛤蜊與四角蛤蜊間的FST=0.965，兩FST值接近。堿基組成顯著差異及分化程度之高均證實(shí)漳州西施舌發(fā)生了極大的遺傳分化。

表5 基于nad5片段的巨蠣屬和貽貝屬貝類的遺傳距離Table 5 Genetic distance of genus Crassostrea and Mytilis based on nad5 fragments

我國學(xué)者孔令峰[1]對福建長樂、山東即墨、日照和江蘇啟東西施舌4個群體貝殼的12個變量數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，長樂群體與北方的3個群體發(fā)生了高度遺傳分化；劉德經(jīng)[2]對長樂和江蘇如東野生西施舌群體貝殼的5個數(shù)量性狀分析結(jié)果認(rèn)為，2個群體西施舌的差異達(dá)到亞種水平。此資料為漳州西施舌分類地位的確定提供了形態(tài)學(xué)的證據(jù)；綜合本研究結(jié)果、前期工作的核基因組DNA標(biāo)記(ITS1[3]和RAPD[14])和線粒體基因組標(biāo)記(cox1[5]和cob[6])及全基因組資料[7, 8]、結(jié)合上述形態(tài)學(xué)資料，提示中國福建西施舌與其它群體間的差異達(dá)到了種間差異水平，應(yīng)該是腔蛤蜊屬的新種。目前腔蛤蜊屬只有兩個種，即西施舌和古氏腔蛤蜊(Coelomactracumingii)，這2個種均為瀕危物種[15]，cox1分析結(jié)果[15]也認(rèn)為福建西施舌與日照西施舌可能是姊妹種，因此，作者建議對福建西施舌進(jìn)行重命名，并對其種質(zhì)資源加強(qiáng)管理和保護(hù)，以確保此優(yōu)良資源的可持續(xù)利用。

[1] Kong L F, Li Q, Qiu Z X. Genetic and morphological differentiation in the clamCoelomactraantiquata(Bivalvia: Veneroida) along the coast of China. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2007, 343(1): 110-117.

[2] 劉德經(jīng), 朱善央. 福建與江蘇西施舌群體形態(tài)差異研究. 南方水產(chǎn), 2010, 6(2): 29-34.

[3] 孟學(xué)平, 高如承, 申欣, 王帥, 程漢良, 董志國, 閻斌倫. 西施舌5個地理群體ITS1序列變異及系統(tǒng)發(fā)生分析. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2010, 30(20): 5555-5561.

[4] Kong L F, Li Q. Genetic evidence for the existence of cryptic species in an endangered clamCoelomactraantiquata. Marine Biology, 2009, 156(7): 1507-1515.

[5] 孟學(xué)平, 申欣, 張波, 程漢良, 田美, 鄭雯雯. 西施舌Cyt b基因核苷酸差異分析. 水產(chǎn)科學(xué), 2010, 29(9): 537-542.

[6] 孟學(xué)平, 高如承, 申欣, 鄭雯雯, 趙娜娜, 程漢良, 田美. 基于COI的中國西施舌DNA條形碼. 水產(chǎn)科學(xué), 2011, 30(10): 626-630.

[7] Meng X P, Shen X, Zhao N N, Tian M, Liang M, Hao J, Cheng H L, Yan B L, Dong Z G, Zhu X L. Mitogenomics reveals two subspecies inCoelomactraantiquata(Mollusca: Bivalvia). Mitochondrial DNA, 2013, 24(2): 102-104.

[8] 孟學(xué)平, 申欣, 趙娜娜, 田美, 梁猛, 郝玨, 程漢良, 閻斌倫, 董志國. 漳州西施舌線粒體基因組全序列: 腔蛤蜊屬(Coelomactra) 存在新種的證據(jù). 海洋學(xué)報(bào), 2013, 35(3): 213-222.

[9] Meng X P, Zhao N N, Shen X, Hao J, Liang M, Zhu X L, Chen H L, Yan B L, Liu Z P. Complete mitochondrial genome ofCoelomactraantiquata(Mollusca: Bivalvia): The first representative from the family Mactridae with novel gene order and unusual tandem repeats. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics, 2012, 7(2): 175-179.

[10] Puslednik L, Serb J M. Molecular phylogenetics of the Pectinidae (Mollusca: Bivalvia) and effect of increased taxon sampling and outgroup selection on tree topology. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2008, 48(3): 1178-1188.

[11] Mao Y L, Gao T X, Yanagimoto T, Xiao Y S. Molecular phylogeography ofRuditapesphilippinarumin the Northwestern Pacific Ocean based on COI gene. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2011, 407(2): 171-181.

[12] Hebert P D, Penton E H, Burns J M, Janzen D H, Hallwachs W. Ten species in one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterflyAstraptesfulgerator. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101(41): 14812-14817.

[13] Hebert P D, Stoeckle M Y, Zemlak T S, Francis C M. Identification of birds through DNA barcodes. PLoS Biology, 2004, 2(10): e312.

[14] 孟學(xué)平, 王帥, 高如承, 申欣, 程漢良, 田美. 西施舌群體遺傳結(jié)構(gòu)及分化的RAPD分析. 海洋科學(xué), 2011, 35(2): 6-9.

[15] Ni L, Li Q, Kong L F, Huang S Q, Li L J. DNA barcoding and phylogeny in the family Mactridae(Bivalvia: Heterodonta): Evidence for cryptic species. Biochemical Systematics and Ecology, 2012, 44: 164-172.

The genetic differentiation analysis onCoelomactraantiquataZhangzhou populations based onnad5: taking that of twoMactraspecies as a reference

MENG Xueping1,*, SHEN Xin1, TU Haimiao1, ZHU Xiaolin1, ZHAO Nana1,2, CHENG Hanliang1, YAN Binlun1

1CollegeofMarineScience,HuaihaiInstituteofTechnology,KeyLaboratoryofMarineBiotechnologyofJiangsuProvince,Lianyungang222005,China2KeyLaboratoryofMarineBiologyofJiangsuProvince,CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China

Class Bivalvia is a group of marine and freshwater molluscs with laterally compressed bodies enclosed by a shell in two hinged parts. Bivalves have been an important source of food for humans. Clams, oysters, ark clams, scallops, cockles and mussels are the most commonly consumed kinds of bivalve, and are eaten raw or cooked. Mactridae, also known as trough shells or duck clams, is an important family of marine bivalve clams of the order Veneroida. Mactridae currently includes about 350 recognized species distributed in the world.Coelomactraantiquata(Bivalvia: Veneroida: Mactridae) was widely distributed along the Chinese coast, north to Dalian city (Liaoning province) and south to Beihai city (Guangxi province), which was most abundant in Fujian province 20 years ago.C.antiquatais one of the valuable and a promising new candidate for aquaculture, and it had been ranked as critically endangered species in China. The research results from morphology and molecular (nuclear DNA and mitochondrial DNA sequences) showed that Fujian (Zhangzhou and Changle)C.antiquataundergone significant differentiation, and it may be a subspecies ofC.antiquataor a cryptic species. Comparative mitochondrial genomic analyses also showed that the differentiation between the Zhangzhu(zz-) and Rizaho (rz-)mtDNA reached the species level. The data above mentioned provide an important background to determine the taxonomic status of ZhangzhouC.antiquata. However, the evidences to determine the taxonomic status based on the current data are insufficient. The variation of NADH dehydrogenase subunit 5 gene (nad5) is larger than 16S rRNA gene and cytochrome oxidase subunit 1 gene, thenad5 differences among different populations can provide more convincing evidence for identifying the differentiation level of FujianC.antiquata. In this study, NAD5 gene fragments of 73 samples were amplified, including four wild populations ofC.antiquata(Rizhao, Lianyungang, Beihai and Zhangzhou) and each population of twoMactraspecies (M.veneriformisandM.chinensis). Then sequenced and 480bp nucleotide sequences of each sample were obtained. Single Nucleotide Polymorphism (SNP) analyses were done to assess the difference level between Zhangzhou and non-Zhangzhou (Rizhao, Lianyungang and Beihai)C.antiquta. Results: A total of 44 haplotypes (Haps) were detected from 73 sequences, including 29 Haps fromC.antiquatafour populations, 10 Haps fromM.veneriformisand five ones fromM.chinensis. There are significant different haplotypes between Zhangzhou and non-Zhangzhou groups. FourC.antiquatapopulations were divided into two groups: non-Zhangzhou group (GP1) and Zhangzhou group (GP2). There are significantly different (P<0.01) on the content of T, A, G between GP1 and GP2. The ratio of intergroup (between GP1 and GP2) and intragroup(GP1 or GP2)nucleotide differences is 25.1—41.8. The ratio of interspecies and intraspecies (M.chinensisandM.veneriformis) differences is 24.4—36.7. Difference between GP1 and GP2 reaching the interspecies differences level ofM.veneriformisandM.chinensis. The genetic distance among Rizhao, Liangyungang and Beihai populations is ranging between 0.009 and 0.012. AMOVA analysis shown that ZhangzhouC.antiquataundergone significantly high genetic differentiation (FST=0.966—0.978,P<0.01). This study suggests that Fujian ZhangzhouC.antiquatahave already differentiated into a new species.

Coelomactraantiquata;Mactraveneriformis;Mactrachinensis;nad5; difference

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20131210); 江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目; 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(2011HS009, 2009HS13); 國家自然科學(xué)基金(40906067); 江蘇省“青藍(lán)工程”人才基金(蘇教師[2010]27號); 中央財(cái)政支持地方高校發(fā)展專項(xiàng)資金資助(CXTD01, CXTD04); 江蘇省海洋資源開發(fā)研究院科技開放基金(JSIMR11B19);江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)

2013-06-09;

日期:2014-05-16

10.5846/stxb201306091547

*通訊作者Corresponding author.E-mail: mxp2002@hotmail.com

孟學(xué)平， 申欣，屠海淼,朱笑琳， 趙娜娜， 程漢良，閻斌論.基于nad5的西施舌漳州群體遺傳分化水平分析——以蛤蜊屬2個物種差異水平為參照.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(8):2635-2642.

Meng X P, Shen X, Tu H M, Zhu X L, Zhao N N, Cheng H L, Yan B L.The genetic differentiation analysis onCoelomactraantiquataZhangzhou populations based onnad5: taking that of twoMactraspecies as a reference.Acta Ecologica Sinica,2015,35(8):2635-2642.