油田硫酸鹽還原菌的分離鑒定及生長特性研究

陳 穎，谷國棟，朱 葛，莫 瑞，何 晗

（東北石油大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，黑龍江大慶163318）

硫酸鹽還原菌（簡稱SRB）廣泛存在于土壤、海水、河水、油氣井及地下管道等缺氧的環(huán)境中，是一種厭氧型的微生物[1]，在油田集輸系統(tǒng)中，SRB 是導(dǎo)致腐蝕的主要因素之一，同時也是引起油層堵塞和油田酸化的主要原因[2]。SRB 將還原為S2-，與集輸管道上的鐵形成硫化物，進而使設(shè)備腐蝕，SRB腐蝕的產(chǎn)物主要是FeO 和Fe（OH）2，腐蝕產(chǎn)物又被油污包裹使管線堵塞，致使注水量下降，影響原油產(chǎn)量。SRB 在集輸系統(tǒng)中生長繁殖而產(chǎn)生的大量腐蝕產(chǎn)物存在于油水界面，逐漸累積，在油田脫水系統(tǒng)中形成過濾層，導(dǎo)致電脫水器運行不穩(wěn)定、跳閘或者擊穿。硫酸鹽還原菌還原所產(chǎn)生的硫化氫不僅污染環(huán)境，而且影響工人的身體健康，石油工業(yè)中的硫化物污染問題和微生物腐蝕問題已經(jīng)引起了高度重視[3]，研究油田SRB 的生長特性對油田防腐和H2S 的抑制都有重要的意義。本文研究了不同溫度、pH 值、鹽度、Fe3+及硝酸鹽等因素對SRB 還原硫酸鹽的影響。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

實驗菌種取自某油田注水系統(tǒng)水樣。

1.2 培養(yǎng)基的選定

硫酸鹽還原菌培養(yǎng)基：CaCl20.1g，F(xiàn)eSO42.5g，Na2SO41.0g，NH4Cl 1.0g，K2HPO40.5g，（NH4）2SO40.5g，乳酸2.5mL，L-半胱氨酸0.6g，0.1%刃天青1mL，酵母膏1.0g；

硫酸鹽還原菌固體培養(yǎng)基：加入2%瓊脂。

1.3 硫酸鹽還原菌的分離純化

在150mL 三角瓶中接種2%的油田水樣，加入液體富集培養(yǎng)基至充滿狀態(tài)，再加入少量石蠟進行密封，在30℃厭氧條件下培養(yǎng)。待培養(yǎng)基變黑且瓶口散發(fā)臭雞蛋氣味時，說明培養(yǎng)基中已存在大量的SRB，采用稀釋涂布-疊皿夾層法進行菌種分離，5d 后，平皿上出現(xiàn)了黑色的球狀菌落即為SRB，在液體培養(yǎng)基中接種挑取的單個菌落進行厭氧培養(yǎng)。反復(fù)進行稀釋涂布-夾層厭氧培養(yǎng)-液體厭氧培養(yǎng)等數(shù)次，便可獲得純SRB 菌株，將其命名為G11。

1.4 分離菌株的16S rDNA 測序

離心收集菌體，按試劑盒（北京普博欣生物）說明提取DNA，使用PCR 擴增儀進行擴增，采用通用引物，16SrDNA序列引物27F：5'-AGAGTTTGATC-CT GGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACT T-3'。

PCR 反應(yīng)體系（25μL）：Taq 酶0.5μL，dNTPs 0.5μL（10 mmol·L-1），1.0μL DNA，10×PCR 緩沖液2.5μL，ddH2O19.5μL，兩個引物1.0μL（10pmol·μL-1）。擴增程序[4]：94℃3min，94℃1min，56℃1min，72℃2min，循環(huán)30 次，再72℃10min，用1.0%瓊脂糖檢測PCR 擴增產(chǎn)物。

所測序列利用Blast 軟件進行序列相似性分析，從GenBank 中選取同源序列，利用鄰位連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），并用Bootstrap 法分析樹的可靠性，迭代100 次。將G11 基因序列和數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA 進行比較，結(jié)果顯示G11 屬于脫硫弧菌（Desulfovibrio），與Desulfovibrio vulgaris RCH1 ctg00052 同源性達到92%。

圖1 以16S rDNA 為基礎(chǔ)的菌珠G11 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic analysis of strain G11 based on 16S rDNA

2 實驗部分

培養(yǎng)基組成：KH2PO40.5g，NH4Cl 1.0g，CaCl2·2H2O 0.1g，Na2SO41.0g，MgSO4·7H2O 2.0g，乳酸鈉（80%）3.5mL，酵母浸膏1.0g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5g，抗壞血酸0.1g，半胱酸胺鹽酸鹽0.5g，蒸餾水1000mL。

試驗菌種為G11 富集培養(yǎng)后菌液，經(jīng)絕跡稀釋法測定其SRB 濃度為1×103mL·L-1，采用間歇實驗，在經(jīng)過高壓蒸汽滅菌鍋滅菌的250mL 細(xì)口瓶中進行，細(xì)口瓶中加入菌液、培養(yǎng)液、硫酸鹽等，用1mol·L-1NaOH 和1mol·L-1HCl 調(diào)節(jié)pH 值，定時取樣測定分析的濃度，考察不同因素對SRB 的影響。

3 結(jié)果與討論

3.1 溫度對SRB 的影響

初始溫度分別為5、10、20、30、40、50、60℃，250mL 細(xì)口瓶中加入180mL 培養(yǎng)基，注入10mL 菌液，調(diào)節(jié)pH 值為7，硫酸鹽濃度調(diào)至為1g·L-1。不同溫度對SRB 的影響見圖2。

圖2 初始溫度對硫酸鹽還原的影響Fig.2 Influence of initial temperature of sulfate reduction

由圖2 可看出，溫度為5℃和10℃時，SRB 還原硫酸鹽受到抑制，其去除率僅為12.26%和20.19%，這是由于環(huán)境溫度很低時，對SRB 的影響主要是影響了細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，因為低溫能減弱蛋白質(zhì)的斥水鍵強度，其立體結(jié)構(gòu)會隨之改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的功能及調(diào)控方式與常溫時不同，因而影響SRB 正常的生理代謝[5]。隨著溫度的逐漸升高，蛋白質(zhì)的合成及功能都恢復(fù)正常，SRB 細(xì)胞中的各種酶的活性逐漸恢復(fù)，從圖中可以看出，當(dāng)溫度為20、30、40℃時，硫酸鹽的去除率分別為77.57%、85.61%、82.93%，此溫度范圍適宜SRB 的生長，30℃為最佳。隨著溫度的繼續(xù)升高，SRB 對硫酸鹽的還原率明顯下降，50℃和60℃時，硫酸鹽去除率為29.85%和9.14%，說明高溫抑制SRB 的生長，這是由于SRB 的生命活動主要是由細(xì)胞內(nèi)的酶催化的，酶又是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的，而蛋白質(zhì)易發(fā)生熱變性，所以高溫導(dǎo)致蛋白質(zhì)變質(zhì)，SRB 的酶失活。馬保國等人研究[6]SRB生長的最適溫度為35℃，本實驗結(jié)果與其較為相符。

3.2 pH 值對SRB 的影響

初始pH 值分別為3、4、5、6、7、8、9、10，250mL細(xì)口瓶中加入180mL 培養(yǎng)基，注入10mL 菌液，硫酸鹽濃度調(diào)至為1g·L-1，在30℃下培養(yǎng)。不同pH 值對SRB 的影響見圖3。

圖3 初始pH 值對硫酸鹽還原的影響Fig.3 Initial pH value on the influence of sulfate reduction

由圖3 可看出，pH 值為4～9，SRB 還原硫酸鹽能正常進行，趨勢為先上升后下降，硫酸鹽的去除率最高為pH為7 時的85.44%，而在pH值為3 和10 的情況下，硫酸鹽的還原受到明顯的抑制，去除率僅為16.28%和24.34%，說明強酸強堿的環(huán)境不適宜SRB 的生長。這是因為過酸過堿改變了核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子所帶的電荷，影響了生物活性；同時過酸過堿也導(dǎo)致了細(xì)胞膜電荷發(fā)生變化，降低了SRB 對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力[7]。劉艷等人[8]證實7.0為SRB 的最佳生長pH 值，在pH 值為5～8 下都能較好的生長，本實驗結(jié)果與之相符。

3.3 鹽度對SRB 的影響

初始鹽度分別為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，250mL 細(xì)口瓶中加入180mL 培養(yǎng)基，注入10mL 菌液，調(diào)節(jié)pH 值為7，硫酸鹽濃度調(diào)至為1g·L-1，在30℃下培養(yǎng)。不同NaCl 含量對SRB 的影響見圖4。

圖4 初始NaCl 含量對硫酸鹽還原的影響Fig.4 The initial impact on sulfate reducing sodium chloride content

3.4 鐵元素對SRB 的影響

加入的Fe0、Fe2+、Fe3+元素濃度為500mg·L-1，250mL 細(xì)口瓶中加入180mL 培養(yǎng)基，注入10mL 菌液，調(diào)節(jié)pH 值為7，硫酸鹽濃度調(diào)至為1g·L-1，加入100mg·L-1的Na2S，在30℃下培養(yǎng)。不同價態(tài)鐵元素對SRB 的影響見圖5。

圖5 鐵元素對硫酸鹽還原的影響Fig.5 The influence of iron for sulfate reduction

3.5 硝酸鹽對SRB 的影響

250mL 細(xì)口瓶中加入180mL 培養(yǎng)基，注入10mL 原菌樣，硫酸鹽濃度調(diào)至為1g·L-1，調(diào)節(jié)S/N分別為5∶0、5∶1、5∶3、5∶5、5∶7，調(diào)節(jié)pH 值為7，在30℃下培養(yǎng)。S/N 對SRB 的影響見圖6。

圖6 S/N 對硫酸鹽還原的影響Fig.6 The influence of S/N of sulfate reduction

從圖6 可以看出，S/N 增加，硫酸鹽的去除率下降，說明硝酸鹽的增多可以明顯抑制SRB 對硫酸鹽的還原。這可能是由于溶液是混合菌樣，其中存在著反硝化細(xì)菌（DNB），它的生活環(huán)境與SRB 極為相似，同屬專性厭氧菌，可存在于同一環(huán)境中。當(dāng)系統(tǒng)中的營養(yǎng)物質(zhì)和基質(zhì)有限時，會產(chǎn)生對生存空間和基質(zhì)的競爭。而許多研究也表明，DNB 與SRB 的競爭占優(yōu)勢，優(yōu)先利用基質(zhì)，進而抑制SRB 的生長，表現(xiàn)出硫酸鹽去除率很低。需要注意的是，S/N 為5∶1 時硫酸鹽去除率75.47%比5∶0 時的72.54%還高，說明此時加入硝酸鹽的量增強了SRB 對硫酸鹽的還原，這可能是因為加入的少量硝酸鹽為環(huán)境提供了氮源[16]，促進了SRB 的生長繁殖，表明低濃度硝酸鹽促進作用高于抑制作用，而在其余的S/N下，都是抑制作用高于促進作用。劉洪玉等人的研究[17]證實硝酸鹽對SRB 的生長確實有抑制作用，并且隨著硝酸鹽濃度的升高抑制效果也隨之提高。

4 結(jié)論

（1）分離提純油田水樣得到一株硫酸鹽還原菌，通過PCR 擴增技術(shù)，和16S rDNA 對比分析，鑒定其為脫硫弧菌屬。

（2）體系在溫度范圍為20～40℃時SRB 還原硫酸鹽的效果較好，其中30℃為最佳溫度，硫酸鹽去除率為85.61%。過高和過低的溫度都不利于SRB的生長，5℃和60℃硫酸鹽去除率僅為12.26%和9.14%。

（3）SRB 在pH 值為4～9 的范圍內(nèi)還原硫酸鹽的效果都較好，其中pH 值為7 時為最佳，硫酸鹽去除率達到了85.44%。pH 值低于4 或高于9 時，會抑制SRB 的生長繁殖。

（4）鹽度主要是影響溶液的滲透壓，鹽度過高會使SRB 的脫水死亡。鹽度在0.5%～2%時，SRB 可以正常生長，在2.5%和3%時硫酸鹽去除率嚴(yán)重下降，僅為18.39%和8.27%，SRB 的生長受到抑制。

（5）不同價態(tài)的鐵元素對SRB 的影響不同，F(xiàn)e0和Fe2+對SRB 的生長起促進作用，而Fe3+的投加則會起到顯著的抑制作用，可以在油田采用Fe3+作為抑制劑抑制SRB 的生長。

（6）硝酸鹽可以抑制SRB 的生長，實驗得出，S/N≤5∶5 就有明顯的抑制效果。

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