液體檢材中Y-羥基丁酸衍生化GC/MS定性分析方法的優(yōu)化*

王蔚昕，張瑞瑛，黃 星

（1.公安部物證鑒定中心，北京100038；2.首都師范大學，北京100037）

Y-羥基丁酸（GHB）具有強烈的鎮(zhèn)靜作用和健忘效果，并能刺激人體分泌荷爾蒙素、增加欣快感，且其無色無味，很容易加入到飲料中而不被發(fā)覺，因此，GHB 往往與性犯罪聯(lián)系在一起，在娛樂場所被濫用[1,2]。GHB 目前在美國已被作為“俱樂部藥物”實行管制，在新加坡列為A 類管制藥物，我國已經(jīng)于2007年將GHB 列為一類精神管制藥物，可見GHB 的濫用已引起各國的高度重視并給予了嚴格的管控。我國販賣GHB 或利用GHB 作為迷奸藥進行搶劫強奸的案件呈逐年上升趨勢，對社會造成的危害日漸嚴重，GHB 的實驗室檢驗要求也隨之增多。目前，國內(nèi)外法庭科學實驗室多采用將GHB 衍生化后用GC/MS 進行定性分析，但缺少液態(tài)檢材基質(zhì)及前體物質(zhì)Y-丁內(nèi)酯（GBL）對GHB 定性結(jié)果影響的系統(tǒng)研究。本研究基于柱前衍生化GC/MS 分析方法，考察了pH 值對GHB 穩(wěn)定性與提取效率的影響、衍生化條件及復雜液態(tài)基質(zhì)對GHB 色譜行為的影響、前體物質(zhì)GBL 對GHB 檢驗結(jié)果的影響，優(yōu)化了樣品前處理方法及色譜條件。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜/ 質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS，島津QP-2010）,配有電子轟擊源。

1mg·mL-1GHB 標準品甲醇液（Cerilliant）；衍生化試劑雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA），含有1%三甲基硅烷（TMCS）（Supelco）；乙腈（Merck）為高效液相色譜級；乙酸乙酯、丙酮、HCl、NaCl、磷酸鹽等均為國產(chǎn)分析純。4 種飲料樣品購于當?shù)爻?，分別為碳酸飲料-雪碧、果汁飲料-“統(tǒng)一”牌橙汁、茶飲料-“統(tǒng)一”牌綠茶和酒精飲料-“燕京”罐裝10P 特制啤酒。

1.2 樣品前處理方法

分別取添加了GHB 標準物質(zhì)的飲料樣品500μL 置于具塞離心試管中，測定樣品溶液pH值。

若pH 值≥6，直接加入乙酸乙酯2mL，渦旋混合5min，3000r·min-1離心分離3min，移除乙酸乙酯層溶液，再用乙酸乙酯2mL 重復提取一次，移除乙酸乙酯層溶液。在水層溶液中加入0.1N HCl 適量并混勻，將其pH 值調(diào)至2～3，加入乙酸乙酯2mL，渦旋混合5min，3000r·min-1離心分離5min，移取乙酸乙酯層溶液；再加入乙酸乙酯2mL 重復提取一次，移取乙酸乙酯層溶液，合并兩次提取液至另一具塞錐形底離心試管中，于35℃空氣流下?lián)]干。殘留物中加入30μL 乙腈和20μL BSTFA（過量衍生化試劑），70℃下反應(yīng)10min，冷卻至室溫，再加入乙酸乙酯0.5mL，待測定。

若pH 值＜6，向樣品溶液中加入0.1N NaOH 溶液適量并混勻，調(diào)節(jié)pH 值至6～7，其余操作同前所述。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件:色譜柱為DB-5 MS 毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；載氣為He，純度≥99.999%；流速1.0mL·min-1；分流進樣，分流比10∶1；初始柱溫60℃，保持2min，以30℃·min-1程序升溫至280℃，保持10min; 進樣口溫度250℃；溶劑延遲時間4.0min。

質(zhì)譜條件:離子源溫度230℃；接口溫度280℃;掃描范圍m/z50～600；數(shù)據(jù)采集模式為全掃描方式。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同基質(zhì)中添加GHB 標準物質(zhì)（10ppm）的BSTFA 衍生化GC/MS 分析結(jié)果

圖1 不同液態(tài)基質(zhì)中GHB 標準物質(zhì)（10ppm）的衍生化GC/MS TIC 圖Fig.1 The TIC of GHB Std in different liquid matrix derivatized with BSTFA analyzed by GC/MS

圖2 GHB BSTFA 衍生物的質(zhì)譜圖Fig.2 The mass spetrum of GHB Std derivatized with BSTFA analyzed by GC/MS

由圖1、2 可見，GHB BSTFA 衍生物保留時間為6.31min，特征碎片離子（m/z）為233、147、73。碎片離子（m/z）147為BSTFA（含有1%三甲基硅烷）衍生物表征衍生化試劑的典型碎片離子；而碎片離子（m/z）233 包含了GHB 自身結(jié)構(gòu)信息，最具有特征性，其結(jié)構(gòu)見圖3。

圖3 m/z 為233 的GHB BSTFA 衍生物碎片離子結(jié)構(gòu)圖Fig.3 The structure of the fragment ion at 233 m/z from GHB Std derivatized with BSTFA analyzed by GC/MS

2.2 方法檢出限

對簡單液態(tài)基質(zhì)中GHB 的分析，檢出限可以達到50ng·mL-1；對各種飲料等復雜液態(tài)基質(zhì)中GHB 的分析，檢出限可以達到100ng·mL-1。由于各種飲料、飲品成分復雜，均含有與GHB 性質(zhì)近似的小分子有機酸類物質(zhì)，比如苯甲酸、蘋果酸、檸檬酸等。該類物質(zhì)與GHB pKa 值接近、溶解性相似，通過調(diào)整pH 值后用特定有機溶劑萃取分離的方法很難去除。在提取過程中，該類物質(zhì)競爭性地抑制了GHB 從水相向有機相的轉(zhuǎn)移，降低了GHB BSTFA衍生物的產(chǎn)率，使分析方法檢出限有所升高。

2.3 實驗條件的優(yōu)化

2.3.1 復雜基質(zhì)樣品經(jīng)過簡單純化的必要性 各種類型飲品中都含有一定量的弱極性脂溶性成分（有機酸、生物堿、多酚類化合物），能夠被乙酸乙酯從水相中萃取出來。當其含量較高時，就會競爭性地抑制GHB 成分從水相向有機相的轉(zhuǎn)移，顯著降低GHB 的提取效率。本研究綜合考慮GHB 的PKa值及其在不同pH 值下游離態(tài)與離子態(tài)的互化特性，通過在適當pH 值下用有機溶劑少量多次萃取的方法，去除了部分堿性、中性、弱酸性脂溶性雜質(zhì)成分，從而達到了有效富集目標成分的目的。

圖4 純化前后，幾種飲料基質(zhì)中GHB 標準物質(zhì)（1×10-6）的衍生化GC/MS 233（m/z）提取離子色譜圖Fig.4 The EIC of ion at 233 m/z from GHB Std（1ppm）in several kinds of beverage derivatized with BSTFA analyzed by GC/MS with or without purification（a:without purification; b:with purification）

由圖4 可知，簡單純化過程可以有效提高GHB的提取效率，降低復雜基質(zhì)中GHB 分析的檢測限。

2.3.2 提取方法中pH 值的選擇 GHB 為小分子有機酸，只有以游離態(tài)存在時，才能被有機相從水相中萃取出來。因此，為了滿足準確定性的要求，一方面，最佳的提取pH 值要能使檢材中GHB 的鹽型最大程度上轉(zhuǎn)化為游離態(tài)并且穩(wěn)定在游離態(tài)，另一方面，檢材中原有的GBL 結(jié)構(gòu)在該pH 值下也能保持穩(wěn)定，不發(fā)生向GHB 的轉(zhuǎn)化。本研究通過實驗發(fā)現(xiàn)，GBL 與GHB 游離態(tài)均在弱酸性條件下比較穩(wěn)定，當提取pH 值為2～3 時，GHB 的提取回收率最高。

2.3.3 衍生化試劑用量對實驗結(jié)果的影響 一方面，各種類型飲料飲品成分復雜，在對飲料基質(zhì)中GHB 衍生物進行檢測時，必須考慮基質(zhì)中其它組分對衍生化試劑的消耗。如果衍生化試劑用量過小，親衍生化試劑物質(zhì)的優(yōu)先發(fā)生反應(yīng)可能導致GHB衍生物產(chǎn)率降低。另一反面，如果衍生化試劑用量過大，未反應(yīng)試劑剩余過多，對色譜柱損害又會較大。不同類型飲料所含物質(zhì)成分差異較大，酒精飲料含有醇類與少量有機酸類物質(zhì)，碳酸、果汁飲料中含有較多小分子有機酸類物質(zhì)，茶飲料中含有較多茶多酚類物質(zhì)（包括黃烷醇類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類等），因此，其主要成分對BSTFA 的競爭性消耗強弱不同。本研究通過實驗發(fā)現(xiàn)衍生化試劑用量為20μL、濃度為40%時，基本同時滿足幾種不同類型飲料樣品的分析需求，使其檢測限均能達到100×10-9，且對色譜柱損害較小。

圖5 不同衍生化試劑用量下，幾種飲料基質(zhì)中GHB 標準物質(zhì)（1×10-6）的衍生化GC/MS 233（m/z）提取離子色譜圖Fig.5 The EIC of ion at 233 m/z from GHB Std（1ppm）in several kinds of beverage derivatized with BSTFA analyzed by GC/MS using different amount of derivatization reagent（a;10μL; b: 20μL）

由圖5 可知，碳酸飲料、茶飲料自身所含物質(zhì)成分對衍生化試劑BSTFA 的競爭性消耗明顯強于酒精飲料，衍生化試劑用量對其所含GHB 成分的檢測結(jié)果有顯著影響。

2.3.4 上機檢測前衍生化終產(chǎn)物稀釋的必要性 衍生化反應(yīng)結(jié)束后，未反應(yīng)的衍生化試劑如果濃度過大會造成色譜柱流失嚴重、柱效降低，對色譜柱損害較大。為了降低柱流失，在實驗中常采用在衍生化反應(yīng)結(jié)束后揮干衍生化試劑、溶劑，用特定有機溶劑重新溶解的方式。但是本研究通過實驗證明，GHB BSTFA 衍生物的揮發(fā)性很強，會隨衍生化試劑一同被揮發(fā)掉（圖6-a），揮干重溶對GHB BSTFA 衍生物的檢測分析不可行。因此，為了降低衍生化副產(chǎn)物和雜質(zhì)對色譜柱和檢測器的不利影響，在進行GC/MS分析前要對待測樣品進行適當稀釋（圖6-b）。

圖6 進樣前對衍生化終產(chǎn)物采用不同處理方式，純水中GHB 標準物質(zhì)（1×10-6）的衍生化GC/MS 233（m/z）提取離子色譜圖Fig.6 The EIC of ion at 233 m/z from GHB Std（1ppm）in water derivatized with BSTFA analyzed by GC/MS processing the derivative in different ways before injection（a;dissolved again with EAC after the evaporation of original solvent; b: diluted with EAC direct）

2.3.5 色譜條件中溶劑延遲時間的設(shè)定 在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，溶劑延遲時間的設(shè)定對檢測結(jié)果有一定影響。實驗表明，適當延長溶劑延遲時間可以有效降低基質(zhì)中含量較高的弱保留組分及其衍生化副產(chǎn)物對目標物檢出的干擾，提高目標組分的檢測靈敏度。對幾種不同類型飲料樣品分別進行了考察，最終將溶劑延遲時間設(shè)為4.0min，基本滿足了不同類型復雜基質(zhì)樣品的檢驗需要。

［1］Elsohly MA,Salamone SJ.J.Anal.Toxicol,1999,23:141-146.

［2］Lebeau M,AndolloM,Hearn WL.J.Forensic Sci.，1999，44:227-230.