逆轉ATP結合盒轉運蛋白參與耐藥的研究進展

司瑞瑞 吳育鋒 孫奮勇▲

1.同濟大學附屬第十人民醫(yī)院檢驗科，上海200072; 2.鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院河南省腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，河南鄭州450003

逆轉ATP結合盒轉運蛋白參與耐藥的研究進展

司瑞瑞1吳育鋒2孫奮勇1▲

1.同濟大學附屬第十人民醫(yī)院檢驗科，上海200072; 2.鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院河南省腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，河南鄭州450003

ATP結合盒(ABC)轉運蛋白超家族利用水解ATP的能量將藥物泵出細胞外，其功能和表達的改變參與了幾乎所有腫瘤多藥耐藥的形成。研究通過作用于跨膜轉運蛋白而逆轉腫瘤多藥耐藥已經(jīng)成為目前的熱點，雖然一系列臨床實驗的失敗使逆轉耐藥的研究遇到了挫折，但是研究仍在推進。在此基礎上，本文主要論述了以ABC轉運蛋白為代表的跨膜轉運蛋白在腫瘤多藥耐藥及逆轉耐藥方面的研究進展，并展望未來研究的方向。

ABC轉運蛋白;腫瘤;多藥耐藥;逆轉耐藥

在對抗腫瘤的過程中，作為主要治療手段之一的化療，由于多藥耐藥現(xiàn)象(multi-drug resistance，MDR)的出現(xiàn)影響了腫瘤化療的效果［1］。ATP結合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉運蛋白超家族成員利用ATP水解的能量跨膜轉運各種底物，包括肽、脂質和抗癌藥物，幾乎參與了所有腫瘤的化療耐藥形成過程。人們已付出大量努力來明確這些蛋白的結構和功能［2-5］，以探索可拮抗其作用并克服MDR(既具有臨床特異性又具有高親和力)的抑制劑。雖然前三代拮抗劑由于不同的原因而失敗了，但研究仍在推進。本文通過對ABC轉運蛋白及逆轉臨床耐藥的新方法進行系統(tǒng)評價，討論出現(xiàn)的問題和取得的經(jīng)驗，對臨床治療工作和未來應用前景有重要的指導意義。

1 ABC轉運蛋白概述

人類基因組包含48個ABC轉運蛋白基因，它們在序列同源性和結構域相似性的基礎上可進一步分為七個不同的亞家族(ABCA～ABCG)。典型的ABC轉運蛋白由兩個高度疏水的跨膜區(qū)(transmembrane domain，TMD)和兩個核苷酸結合區(qū)(nucleotide-binding domain，NBD)組成，少數(shù)ABC轉運蛋白只有一個NBD和一個TMD組成(半轉運蛋白)，比如ABCG2(breast cancer resistance protein，BCRP)，被稱為半轉運蛋白，通過形成二聚體來發(fā)揮功能［6-7］。目前研究最多的是P-糖蛋白(P-gp，ABCB1)、多藥耐藥性蛋白(MRP1，ABCC1;MRP2，ABCC2)和乳腺癌耐藥蛋白(BCRP，ABCG2)。

1.1 P-gp

P-gp的檢測和分離最初是由Juliano等［8］于1976年在具有MDR表型的中國倉鼠卵巢癌細胞中發(fā)現(xiàn)的，位于人染色體7q21.1，它是由MDR1基因編碼的170 kDa的質膜蛋白［9-10］。在生理條件下，P-gp主要表達于由上皮細胞內(nèi)襯的排泄器官(如肝、腎、腸、肺和腎上腺)、血液-組織的毛細血管內(nèi)皮細胞的近頂膜處(如血-腦，血-肇丸屏障等)。

P-gp利用ATP水解提供的能量將親脂疏水性藥物主動泵出到細胞外，致使細胞內(nèi)藥物濃度降低而產(chǎn)生耐藥。P-gp通過將外來物質泵出細胞以減少對細胞本身的傷害，它的跨膜區(qū)域結合帶有中性正電荷的疏水性底物，可將底物從脂質雙分子層遞呈給轉運蛋白［11］。綜合文獻報道，P-gp膜轉運蛋白參與了長春堿類、蒽類化合物、紫杉醇類等藥物耐藥性的形成。P-gp作用方式就像“疏水真空泵”，當化療藥物經(jīng)濃度梯度進入細胞后與P-gp底物結合區(qū)結合，同時NBD水解ATP;隨后，P-gp構型發(fā)生改變，藥物由蛋白的高親和位點移到低親和位點并被排出胞外［12］。其次，P-gp還可使胞內(nèi)藥物重新分布，使藥物聚集在細胞器如溶酶體內(nèi)，進一步使化療藥物脫離作用靶點，從而導致耐藥。另外，P-gp對細胞程序性凋亡級聯(lián)反應有抑制作用，從而提高了腫瘤細胞的存活率［13］，并能保護耐藥細胞免于細胞毒性藥物的攻擊及Fas配體誘導的多種形式的半朧氨酸依賴性凋亡［14］。

1.2 多藥耐藥性蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)

MRP最初在多柔比星耐藥的H69AR肺腫瘤細胞中被檢測到，約190 kD［15］。MRP主要表達于人體許多正常組織內(nèi)，尤其高表達于血-腦屏障的脈絡細胞基底外側膜上，以及支氣管上皮細胞、胎盤中［16-18］。不同于P-gp的是，MRP不能轉運未經(jīng)修飾的化療藥物的天然產(chǎn)物，但可轉運經(jīng)生物轉化后與谷朧甘肽(glutathione，GSH)結合的產(chǎn)物［19］。MRP1的活性可以被GSH增強，這使得它可以輸送許多中性和堿性的藥物［20］。另外，MRP1可調節(jié)細胞氧化應激和氧化還原之間的平衡，保持靈敏的免疫反應性［21-22］。MRP1可廣泛介導轉運腫瘤細胞內(nèi)的抗癌藥物，包括長春花生物堿、蒽環(huán)類、表鬼臼毒素、紫杉烷、氨甲蝶吟和喜樹堿［23-24］。

MRP蛋白介導的耐藥機制與P-gp不同的是，MRP并不能獨立泵出未經(jīng)修飾的化療藥物及其天然代謝產(chǎn)物，它的底物需要與還原型GSH相結合，通過MRP/GS-X泵外排。GSH也可調節(jié)MRP蛋白對藥物的轉運，降低GSH的胞內(nèi)濃度將影響MRP2蛋白的轉運功能;而GSH合酶的抑制劑(如:丁硫氨酸亞礬胺等)可逆轉MRP蛋白對柔紅霉素的耐藥性。另外有報道指出，柔紅霉素的胞內(nèi)聚集與胞內(nèi)GSH水平呈負相關［25］。還有研究表明，MRP參與了更多底物的耐藥，如喜樹堿衍生物、順鉑、長春堿類和多柔比星等的耐藥［26］。

1.3 乳腺癌耐藥蛋白

BCRP最早被發(fā)現(xiàn)在多柔比星抵抗的MCF7/AdrVp乳腺癌細胞中［27］。BCRP基因定位于4q22.23，它是一個有665個氨基酸的(75 kDa)ABC半轉運蛋白，僅具有1個TMD和1個NBD。在跨膜轉運中，單體BCRP形成二聚體或多聚體［28］。BCRP主要定位于一些健康組織細胞的頂膜，包括胎盤合體細胞、肝細胞和腸黏膜細胞中，在那里它可能通過外排潛在的破壞性毒素，以保護胎兒，或將毒素外排至膽管和腸腔等特定的體腔［29］。在大腦微血管，BCRP駐留在微血管內(nèi)皮細胞的管腔側，通過血腦屏障限制了毒物的滲透性［30］。同時，BCRP也參與維持細胞內(nèi)激素和葉酸的動態(tài)平衡，主要通過轉運類固醇結合物以及葉酸和它的谷氨酸聚合物來實現(xiàn)［31-32］。

研究證實，BCRP的耐藥機制也具有自身的特點，即BCRP單體之間通過二硫鍵形成同二聚體，使結構近似于完全轉運蛋白，而后再發(fā)揮藥物排出泵的功能［33-34］。Zhou等［35］發(fā)現(xiàn)BCRP可使細胞內(nèi)比生群、米托蒽醒、拓撲替康、柔紅霉素、羅丹明和哌哇嗪等藥物的濃度下降。另外有報道指出，在生理pH值條件下BCRP具有轉運甲氨蝶吟、葉酸的功能［36］。Shulenin等［37］的研究顯示，低pH值環(huán)境可提高BCRP對藥物的轉運作用。

1.4 其他ABC轉運蛋白

ABCA1廣泛表達于腎上腺及子宮中，高表達于肝和腦，在調節(jié)脂蛋白代謝方面具有重要作用，在載脂蛋白的刺激下，轉運膽固醇和磷脂通過胞膜［33-34］。ABCA2主要表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，介導細胞內(nèi)脂質運輸［33，35-36］。ABCA3高表達于肺泡Ⅱ型細胞，參與合成和分泌肺表面活性物質［37］。ABCA4與視網(wǎng)膜細胞磷脂轉運有關［38］。ABCA12在角質細胞表面參與轉運葡萄糖［39］。還有一些成員參與神經(jīng)退行性疾病過程，如: ABCA1調節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽固醇濃度和淀粉樣前體蛋白加工產(chǎn)生的神經(jīng)毒性淀粉樣蛋白［40-42］;ABCA7與阿爾茨海默病密切相關［43］;ABCA13參與精神分裂癥和雙相情感障礙［44］。ABCD亞科包含由4個基因編碼的半轉運體。ABCD1與腎上腺腦白質營養(yǎng)不良(ALD)疾病有關。其他ABCD家族基因的功能還沒有被制訂出來，但其序列相似性表明，它們可能參與脂肪酸代謝。ABCE亞科包含單個成員，如OABP、ABCE1，這種蛋白質識別某些病毒感染后產(chǎn)生的寡聚腺苷酸。

2 逆轉多藥耐藥現(xiàn)象的研究現(xiàn)狀

第一代抑制劑已被批準用于臨床，包括奎尼丁、醋酸甲地孕酮、他莫昔芬、維拉帕米以及環(huán)抱菌素A。維拉帕米是第一個P-gp的抑制劑，它能直接與抗癌藥物競爭ABC轉運蛋白的外排作用，使得抗癌藥物在細胞內(nèi)保持較高的濃度，從而逆轉MDR作用。在第Ⅰ期臨床試驗研究評估中，其產(chǎn)生P-gp抑制作用的劑量閡值較高，這導致了較大的心臟毒性［45］而未能應用于臨床。另外，觀察其他第一代抑制劑，雖沒有太大的毒性，但在隨機臨床試驗中缺乏有效的差異性［46-47］而中止。

第二代抑制劑為第一代抑制劑的衍生物，以增加在正常組織中對ABC轉運蛋白的抑制，提高治療指數(shù)并減少毒性為目的。該類藥物包括環(huán)胞素A的衍生物代司樸達(Valspodar，PSC833)、以維拉帕米為結構基礎的S9788、奎尼丁的類似物比立考達(Biricodar，VX-710)及MS209等。大多數(shù)這些抑制劑可抑制細胞色素P450同工酶3A4介導的抗癌藥物如紫杉醇和長春新堿的代謝作用，從而使患者血液中的藥物濃度增高而增加毒副作用［48］。多非喹達(MS209)被證明可使對多西他賽和紫杉醇耐藥的B16黑色素瘤重新獲得化療敏感性，同樣的實驗結果也表現(xiàn)在大腸癌HCT-15和小乳腺癌MCF-7移植瘤中［49］。但是多非喹達雖然沒有增加毒性，但是在與環(huán)磷酰胺、阿霉素、氟尿嘧啶聯(lián)合用藥時對晚期或復發(fā)性乳腺癌無進展生存期(PFS)并沒有改善［50］。該類藥物可干擾化療藥物代謝，抑制其他轉運蛋白超家族的成員，并帶來不可預知的毒副作用，使重要臟器的解毒能力降低，因此，雖然該類藥物有逆轉活性高且無心血管毒性的特點，但仍未能應用于臨床。

第三代抑制劑有高效力的ABC轉運蛋白抑制作用，可特異性的與P-gp作用，并可減少化療藥帶來的藥物毒性，具有良好的開發(fā)前景。此類抑制劑的優(yōu)點在于它不是細胞色素P450的底物，因而不會改變與其合用的抗癌藥物的藥動學性質。同時它對其他轉運蛋白超家族的影響較小，從而最大限度地減少了對其他轉運蛋白的抑制而產(chǎn)生的副作用。但是因為大多數(shù)人對這些藥物仍然產(chǎn)生了較大的副作用而使臨床試驗(Ⅱ期或Ⅲ期)終止。例如，Tariquidar(XR-9576)，是鄰氨基苯甲酰胺的衍生物，無論是在體外和體內(nèi)都表現(xiàn)出可高效力的逆轉P-gp介導的多藥耐藥，在裸鼠體內(nèi)Tariquidar可完全恢復耐藥小細胞肺癌和卵巢癌異種移植物對紫杉醇、依托泊苷、長春新堿的抗腫瘤活性［51］。盡管如此，Tariquidar在Ⅱ期臨床研究完成之前仍然被終止了，因有研究表明它與其他化療藥物合用后，其毒性比對照組更強。Biricodar(VX-710)增加腫瘤細胞對米托蒽醒、阿霉素、柔紅霉素的吸收和保留，并在抗P-gp、MRP1和BCRP過表達的過程中恢復腫瘤細胞的敏感性［52-53］。Ⅱ期臨床研究與阿霉素和長春新堿的組合因藥物毒性和沒有明顯改善患者小細胞肺癌的復發(fā)率而終止［54］。

3 逆轉ABC轉運蛋白所致MDR的展望

3.1 針對ABC轉運蛋白的單克隆抗體

有證據(jù)表明，在體內(nèi)體外研究中單克隆抗體(如MRK16、UIC2和HYB-241)可特異性結合于P-gp，可以通過抑制許多化療藥物的外排作用而提高化療效果(例如，柔紅霉素、阿霉素、長春新堿、依托泊苷、紫杉醇)［55-56］。該MRK16抗體識別人P-gp的表位，并能至少部分地逆轉P-gp在相關組織中的表達［57］。

3.2 抑制相關的信號轉導及核受體

在腫瘤細胞中ABC藥物轉運蛋白的過度表達可能通過干擾其信號轉導途徑而受到抑制。有研究通過靶向轉錄因子阻斷hedgehog通路，增加了對長春新堿和依托泊苷的敏感性，通過抑制P-gp和MRP1的表達緩解膠質瘤細胞耐藥［58］。

3.3 納米載體

納米載體分為磁性納米載體、聚酰胺-胺行樹枝狀高分子(PAMAM)、穹窿體。磁性納米載體中的鐵氧化物Fe3O4納米顆粒的磁性最強，易實現(xiàn)靶向定位。將化療藥物裝入Fe3O4顆粒中作用于腫瘤細胞將減少化療藥物的外排及下調轉運蛋白的表達。PAMAM是一個球形分子，其優(yōu)點是具有低毒性、幾乎無免疫原性。它可以聯(lián)合轉運抗癌藥物和siRNA，通過改變細胞內(nèi)藥物分布逆轉MDR。此外，siRNA與化療藥物結合可表現(xiàn)出令人滿意的基因沉默效果，使化療藥物進入細胞，誘導更多的細胞毒性。穹窿體的優(yōu)點在于體積小(小于100 nm)，其外殼可防止外來蛋白酶侵犯且不會引起體內(nèi)免疫反應，可特異地定位于細胞表面受體，轉運特定藥物。

3.4 生物技術

短發(fā)夾狀RNA(shRNA)和siRNA技術是基因沉默的一種手段，他們通過慢病毒及質粒等載體的攜帶可以靶向沉默MDR1、MRP1、MRP4、BCRP等基因，從而抑制相應的跨膜轉運蛋白的表達，進而減少抗癌藥物的外排，達到逆轉耐藥的作用。例如:MDR1及MDR3基因沉默能恢復A2780/taxol細胞對紫杉醇的敏感性并誘導細胞凋亡，從而逆轉A2780/taxol細胞對紫杉醇的耐藥性［59］。

4 小結

隨著對ABC轉運蛋白的結構和功能的了解日益深入，大量的基礎和臨床研究已經(jīng)介入，抑制這些轉運蛋白的活性、提高抗癌療效的藥物研發(fā)已經(jīng)著手。但是目前評估這些藥物的臨床試驗還正在挫折中前行。展望新的戰(zhàn)略，如涉及RNAi技術和納米粒子等研究不斷創(chuàng)新，可能會克服以前幾代抑制劑的局限性。雖然說MDR是一個復雜的現(xiàn)象，源于不同的機制，但是繼續(xù)研究抑制MDR以造?；颊呤侨祟惖淖非蟆?/p>

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Research progress of reverse ATP-binding cassette transporters involved in drug-resistance

SI Ruirui1WU Yufeng2SUN Fenyong1▲1.Department of Clinical Laboratory，the Tenth People’s Hospital Affiliated to Tongji University，Shanghai200072，China；2.Department of Internal Medicine，Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University He’nan Cancer Hospital，He’nan Province，Zhengzhou450003，China

ATP-binding cassette(ABC)transporter protein superfamily uses the energy of ATP hydrolysis to pump drugs out of cells，its change of expression is involved in the formation of multi-drug resistant in almost all types of tumors.Research on reversing multidrug resistance of tumor by acting on the transmembrane transporter has become a hot issue.Although the failure of a series clinical trials which try to reverse it，the research is still in progress.On this basis，this paper discusses the progress in research on transmembrane transporter with ABC transporter protein as representative in multidrug resistance of tumor，the study of drugs focusing on reversal of multidrug resistance，and the future direction of research.

ABC transporter protein；Tumor；Multidrug resistance；Reversal of drug-resistance

R92

A

1673-7210(2015)02(c)-0150-06

2014-11-22本文編輯:程銘)

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