隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC—7901細(xì)胞增殖及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)的影響

鄧?guó)P春++++++于占江++++++楊鈺等

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院普外科，

黑龍江齊齊哈爾 161001；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生理教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006

[摘要] 目的 通過(guò)測(cè)定隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）mRNA的影響，探討其抗腫瘤的作用機(jī)制。 方法 采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響，采用Real Time RT-PCR檢測(cè)隱丹參酮對(duì)VEGF mRNA表達(dá)的影響。 結(jié)果 20、40、60、80、100 μmol/L的隱丹參酮作用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞6～48 h，其生長(zhǎng)和增殖均受到一定程度的抑制；24 h為隱丹參酮對(duì)SGC-7901細(xì)胞抑制作用的最佳時(shí)間，IC50為59.11 μmol/L；選取40、60和80 μmol/L 3個(gè)劑量作用于人胃癌細(xì)胞SGC7901 24 h后，60和80 μmol/L的隱丹參酮均可下調(diào)VEGF mRNA的表達(dá)（均P < 0.01）。 結(jié)論 隱丹參酮可抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，并能抑制VEGF mRNA的表達(dá)，提示這可能是其抗腫瘤的作用機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞] 隱丹參酮；人胃癌SGC-7901細(xì)胞；四甲基偶氮唑藍(lán)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

[中圖分類號(hào)] R735.2，R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）02（c）-0007-04

隱丹參酮（cryptotanshinone，CPT）是從活血化瘀中藥丹參中提取出的有效成分，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，能夠在一定程度上阻礙腫瘤細(xì)胞侵襲和防止其向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，具有抗腫瘤細(xì)胞的活性，且抗瘤譜較廣，日益受到關(guān)注[1]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前最重要的血管生成刺激因子之一，在腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移中起著重要作用，可誘導(dǎo)體外內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移及體內(nèi)血管生成[2]。本研究檢測(cè)不同濃度的隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖及VEGF mRNA表達(dá)的影響，探討隱丹參酮抗腫瘤的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

人胃癌SGC-7901細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 藥品及試劑

隱丹參酮購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司（HPLC≥98%）；胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青生物工程材料研究所；RPMI 1640培養(yǎng)基及細(xì)胞消化液胰酶（Tyrisin）為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；VEGF和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）引物由TAKARA公司合成；RNAiso Reagent、PrimeScriptTM RT reagent Kit試劑盒及SYBR？誖Premix Ex TaqTM試劑盒均為TAKARA公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器

倒置顯微鏡（IMT-2）產(chǎn)自O(shè)lympus公司；超凈工作臺(tái)產(chǎn)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；CO2孵箱產(chǎn)自Thermo Electron公司；-80℃超低溫冰箱產(chǎn)自日本SANYO公司；酶標(biāo)儀產(chǎn)自美國(guó)Bio-rad公司；7300 Real Time PCR System產(chǎn)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1 增殖抑制試驗(yàn)（MTT法）

隱丹參酮用DMSO配成一定濃度的儲(chǔ)備液，過(guò)濾除菌，分裝凍存，臨用再前用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度，DMSO的終濃度≤0.1% （V/V）。

取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的SGC-7901細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板內(nèi)，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)4 h后，設(shè)空白對(duì)照組和5個(gè)不同濃度的隱丹參酮組（終濃度為20、40、60、80、100 μmol/L），每種濃度5個(gè)復(fù)孔。除空白對(duì)照組外，每孔中加入相應(yīng)濃度的隱丹參酮，分別刺激6、12、24、48 h后，加入0.5%MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；小心吸去培養(yǎng)液；每孔加入150 μL DMSO，置37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀570 nm/630 nm（主波長(zhǎng)570 nm，參比波長(zhǎng)630 nm）測(cè)量各孔的吸光值并計(jì)算抑制率。抑制率=（對(duì)照組OD值-用藥組OD值）/對(duì)照組OD值×100%。每組去掉一個(gè)OD值最低值和一個(gè)最高值，取剩余3個(gè)復(fù)孔OD值來(lái)計(jì)算。

1.2.2 熒光實(shí)時(shí)定量PCR

取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的SGC-7901細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)4 h后，設(shè)空白對(duì)照組和3個(gè)不同濃度的隱丹參酮組（終濃度為40、60、80 μmol/L）；于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，孵育24 h，收取各組細(xì)胞用Real Time RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞的VEGF mRNA的表達(dá)。

1.2.2.1 抽提總RNA 按RNAiso Reagent操作說(shuō)明書提取各組細(xì)胞的總RNA，紫外分析及電泳檢測(cè)總RNA的純度、濃度及完整性。

1.2.2.2 單鏈cDNA的合成 采用PrimeScriptTM RT Reagent Kit試劑盒，嚴(yán)格按說(shuō)明書操作。各目的基因的引物序列[3]及產(chǎn)物大小如下：VEGF：Forward 5'-TTG-CTGCTCTACCTCCAC-3'，Reverse 5'-AATGCTTTCT-CCGCTCTG-3'，417 bp；β-actin：Forward 5'-CCATGTACGTTGCTATCCAGG-3'，Reverse 5'- TCTCCTTAA-TGTCACGCACGA-3'，252 bp。

1.2.2.3 Real Time PCR 采用SYBR？誖Premix Ex TaqTM試劑盒，應(yīng)用ABI 7300 Real Time PCR System采用兩步法PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性 95 ℃，10 s（1個(gè)循環(huán)）；PCR反應(yīng) 95 ℃，5 s，60 ℃，31 s（40個(gè)循環(huán)）。

1.2.2.4 產(chǎn)物分析 使用Sequence Detection software version 1.2.3軟件（Applied Biosystems公司）分析PCR過(guò)程各檢測(cè)樣本的閾循環(huán)（Threshold cycle，CT），閾循環(huán)值隨模板濃度增大而減少。每個(gè)樣本均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，內(nèi)參照基因亦設(shè)5個(gè)復(fù)孔。采用2-△△■的方法[4]分析VEGF mRNA表達(dá)水平（△CT=CT 目的基因-CT β-actin，△△CT=△CT各干預(yù)組-△CT空白對(duì)照組）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響

以20、40、60、80、100 μmol/L的隱丹參酮作用于SGC-7901細(xì)胞6～48 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制情況。實(shí)驗(yàn)表明，隱丹參酮能明顯抑制SGC 7901細(xì)胞的增殖，隨著藥物濃度及作用時(shí)間的增加，抑制作用也逐漸增強(qiáng)，尤以刺激24 h和48 h明顯，呈劑量與時(shí)間依賴性。由于刺激48 h后，最低濃度的隱丹參酮對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制率已超過(guò)50%，故選取24 h作為隱丹參酮對(duì)SGC-7901細(xì)胞抑制作用的最佳時(shí)間。見表1。

刺激24 h后，隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用與藥物濃度之間呈線性關(guān)系（y = 0.498x+20.56，R2=0.972），并由此計(jì)算出隱丹參酮對(duì)SGC-7901細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為59.11 μmol/L，故選取40、60、80 μmol/L 3個(gè)劑量作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中隱丹參酮的給藥濃度。

表1 不同濃度隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的

抑制作用（%，x±s，n = 3）

2.2 隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)的影響

以40、60、80 μmol/L的隱丹參酮作用于SGC-7901細(xì)胞24 h后，通過(guò)2-ΔΔ■法計(jì)算各組SGC-7901細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)水平，見表2。

由表2和圖1可見，與空白對(duì)照組相比，40 μmol/L隱丹參酮組的VEGF mRNA的表達(dá)量雖有所減低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），而60 μmol/L和80 μmol/L隱丹參酮組的VEGF mRNA的表達(dá)量均較空白對(duì)照組明顯降低（均P < 0.01），且有隨藥物濃度的增加而逐漸減少的趨勢(shì)，其量效曲線呈對(duì)數(shù)關(guān)系，y = -0.6854Ln（x）+3.3759，R2=0.9884。

表2 不同濃度隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)的影響（x±s，n = 5）

注：與空白對(duì)照組比較，**P < 0.01；與40 μmol/L隱丹參酮組比較，#P < 0.05，##P < 0.01；VEGF：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；CT：閾循環(huán)

VEGF：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

圖1 隱丹參酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)的

量效曲線

3 討論

胃癌在全世界的發(fā)病率都很高，根治性切除術(shù)是目前唯一可以治愈胃癌的方法，但大部分患者術(shù)后會(huì)發(fā)生局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[5]。因此，研究更有效的治療藥物以延長(zhǎng)患者的生存期，提高患者的生活質(zhì)量一直是備受關(guān)注的熱點(diǎn)。

中藥以其天然、毒副作用小的優(yōu)勢(shì)為抗腫瘤研究提供了新的思路和方法。隱丹參酮是中藥丹參中具有很強(qiáng)代表性的脂溶性有效組分。大量研究證實(shí)，隱丹參酮具有廣譜的胞毒效應(yīng)，如黑色素瘤、膽管癌、白血病等[6-8]，故其在腫瘤治療方面具有較大的臨床藥用開發(fā)價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮能明顯抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖，藥物作用顯示出顯著的劑量-時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系；且24 h為隱丹參酮對(duì)SGC-7901細(xì)胞抑制作用的最佳時(shí)間，IC50為59.11 μmol/L。

腫瘤血管的生成是腫瘤無(wú)限增殖和轉(zhuǎn)移的必要條件[9]，而腫瘤血管的生成是由一系列促血管生成因子而引發(fā)和維持的病理血管生成過(guò)程。VEGF是目前最重要的促血管生成因子之一，且在腫瘤組織中有較高表達(dá)[10-11]。抑制VEGF的表達(dá)不但可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，還可以抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，故抗腫瘤血管生成可能成為治療腫瘤新的方法。卞維鵬等[12]研究表明，隱丹參酮是一種新的小分子血管生成抑制劑，由此推測(cè)隱丹參酮可能通過(guò)抑制血管生成起到一定的抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn)，以不同濃度的隱丹參酮（40、60、80 μmol/L）作用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞24 h后，經(jīng)Real Time RT-PCR法檢測(cè)后表明：VEGF mRNA表達(dá)下調(diào)，且隨藥物濃度的增加而逐漸減少。

綜上所述，隱丹參酮不僅能抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，還能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)而具有潛在的抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用，但機(jī)制尚不十分清楚。隨著研究的不斷深入，將會(huì)更深層次地探究隱丹參酮抑制腫瘤細(xì)胞增殖及抗腫瘤血管生成的分子機(jī)制。

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（收稿日期：2014-11-24 本文編輯：程 銘）