環(huán)狀RNA在炎癥所致早產(chǎn)小鼠腦損傷中的作用及機(jī)制初步研究

魏思萌 肖謐 鄭曦 劉俐

（西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院新生兒科，陜西西安 710061）

［中國(guó)當(dāng)代兒科雜志，2021，23（7）：730-734］

母親孕期炎癥反應(yīng)（如絨毛膜羊膜炎）是目前公認(rèn)嬰兒早產(chǎn)的重要原因。病原體感染后，可經(jīng)陰道上行到胎膜，或經(jīng)母血到胎盤使早產(chǎn)發(fā)生，甚至引起胎兒炎癥反應(yīng)的激活。同時(shí)，胎兒炎癥反應(yīng)的激活可影響其正常的腦神經(jīng)發(fā)育，造成早產(chǎn)兒髓鞘形成、軸突完整性及突觸發(fā)生等事件受抑制，影響腦白質(zhì)和深部灰質(zhì)的發(fā)育，從而引起腦結(jié)構(gòu)和功能的改變、行為及認(rèn)知障礙等嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥［1-2］。近年來，隨著早產(chǎn)兒腦損傷發(fā)生機(jī)制的不斷研究，多種蛋白編碼基因如Cdk2基因、Wnt/βcatenin、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、炎性細(xì)胞因子等被證明參與炎癥所致早產(chǎn)腦損傷的發(fā)生及發(fā)展［3-5］，但仍未闡明其調(diào)節(jié)關(guān)鍵點(diǎn)，轉(zhuǎn)化為臨床新防治手段有一定難度。

本課題組已成功建立炎癥誘導(dǎo)早產(chǎn)小鼠腦損傷模型，并在證實(shí)lncRNA在早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷發(fā)病機(jī)制中起重要作用的基礎(chǔ)上［5-6］，發(fā)現(xiàn)一類環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）。circRNA是一類具有穩(wěn)定閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性RNA分子，序列高度保守，在哺乳動(dòng)物中大量并穩(wěn)定存在。相比于lncRNA、微 小RNA（microRNA，miRNA）等，circRNA功能及作用機(jī)制更豐富［7-9］，更易實(shí)現(xiàn)對(duì)編碼基因的多層次體外調(diào)控并獲得臨床應(yīng)用價(jià)值。已有研究表明，circRNA與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、分化和生物學(xué)功能有密切關(guān)系［10-12］，但目前circRNA與早產(chǎn)腦損傷的相關(guān)性研究甚少。本研究通過微陣列基因芯片技術(shù)篩選與炎癥誘導(dǎo)早產(chǎn)腦損傷相關(guān)的差異表達(dá)circRNA，初步探討circRNA在炎癥所致早產(chǎn)腦損傷中的作用，尋找早產(chǎn)腦損傷早期診治的新突破口。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

本研究所用的雌性BALB/c小鼠與雄性C57BL/6小鼠由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，研究?jī)?nèi)容已經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2020-229）。所有方法均按照相關(guān)指南和規(guī)定執(zhí)行。脂多糖購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；GeneChip Mouse Transcriptome（MT）Array 1.0芯片購(gòu)自美國(guó)Affymetrix公司；芯片數(shù)據(jù)分析由上?？党晒咎峁籘RIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 炎癥誘導(dǎo)早產(chǎn)小鼠腦損傷模型制備

4只C57BL/6雄性小鼠和10只BALB/c雌性小鼠在SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)至7周齡。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，雌雄小鼠按2∶1配種，每日觀察2次。檢測(cè)到陰道栓當(dāng)日定為妊娠第0天。將孕鼠隨機(jī)分為炎癥早產(chǎn)組（n=3）：妊娠17 d時(shí)孕鼠腹腔注射適量脂多糖（125μg/kg），在第18天產(chǎn)活仔；非炎癥早產(chǎn)組（n=3）：孕鼠腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，孕18 d時(shí)給予2%異氟醚進(jìn)行呼吸麻醉，剖宮產(chǎn)法取胎鼠［5-6］。取兩組早產(chǎn)小鼠腦組織置于液氮中快速冷卻保存。

1.3 樣本總RNA的提取與檢測(cè)

使用TRIzol試劑從胎鼠腦組織中提取總RNA，并使用RNeasy mini試劑盒（Qiagen，Hilden，德國(guó)）按照說明書進(jìn)行純化。使用1%變性凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。采用納米滴分光光度計(jì)ND-2000測(cè)定RNA濃度和純度，樣品光密度（OD）260/OD280為1.8～2.1，OD260/OD230＞1.8為合格樣品。

1.4 芯片雜交

兩組各取3只仔鼠腦組織，共6個(gè)樣本。分別對(duì)6個(gè)樣本中提取的總RNA進(jìn)行circRNA表達(dá)分析，用Rnase R（Epicentre Technologies，Madison，美國(guó)）消化總RNA，去除線性RNA，豐富circRNA。之后通過隨機(jī)引物法（Arraystar Super RNA Labeling Kit，美國(guó)）擴(kuò)增并轉(zhuǎn)錄成熒光cRNA。將標(biāo)記的RNA雜交到Arraystar Human circRNA陣列（Rockville，美國(guó)）。洗完載玻片后，用安捷倫掃描儀G2505C對(duì)陣列進(jìn)行掃描。采用Agilent Feature Extraction軟件（version 11.0.1.1）對(duì)獲取的陣列圖像進(jìn)行分析。以上芯片測(cè)序部分在上?？党晒具M(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。運(yùn)用miRanda軟件分析預(yù)測(cè)circRNA可能結(jié)合的miRNA。

2 結(jié)果

2.1 腦組織樣本總RNA質(zhì)檢結(jié)果

所有腦組織樣本總RNA的OD260/OD280值均在1.8～2.2之間，瓊脂糖凝膠電泳可見28S和18S兩條核糖體RNA條帶（圖1），質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果全部通過（表1），可用于后續(xù)芯片檢測(cè)。

表1 小鼠腦組織RNA質(zhì)檢結(jié)果

圖1 腦組織樣本總RNA電泳圖 注：1～3分別為炎癥組小鼠腦組織3個(gè)樣本；4～6分別為非炎癥組小鼠腦組織3個(gè)樣本。

2.2 circ RNA差異表達(dá)譜可視分析

將質(zhì)檢合格的6份樣本進(jìn)行芯片檢測(cè)，將所得芯片結(jié)果進(jìn)行預(yù)處理、歸一化后選擇相對(duì)表達(dá)量比值在1.5倍以上，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的circRNA作為差異表達(dá)的circRNA（P＜0.05）。根據(jù)芯片檢測(cè)結(jié)果繪制散點(diǎn)圖，結(jié)果顯示炎癥早產(chǎn)組和非炎癥早產(chǎn)組間共篩選出365種差異表達(dá)的circRNA，其中差異表達(dá)上調(diào)有206種，差異表達(dá)下調(diào)有159種，見圖2。

圖2 差異表達(dá)circ RNA的散點(diǎn)圖 圖中每個(gè)散點(diǎn)代表1種circRNA表達(dá)信號(hào)，散點(diǎn)顏色由藍(lán)色向紅色漸變，代表不同circRNA在樣品中的表達(dá)量越高。高低綠色斜線為circRNA差異表達(dá)倍數(shù)的閾值線（差異倍數(shù)=±1.5），即綠色高線之上的點(diǎn)為差異表達(dá)上調(diào)1.5倍以上的circRNA，共206種；綠色低線之下的點(diǎn)為差異表達(dá)下調(diào)1.5倍以上的circRNA，共159種。

2.3 差異表達(dá)circ RNA的數(shù)據(jù)分析

分別對(duì)差異表達(dá)上調(diào)和下調(diào)倍數(shù)最高的前10條circRNA進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的circRNA類型主要為外顯子circRNA、重疊區(qū)circRNA等，可參與轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡等眾多生物學(xué)過程。其中上調(diào)差異表達(dá)倍數(shù)最高為circRNA_45982，其差異表達(dá)倍數(shù)為3.41倍。下調(diào)差異表達(dá)倍數(shù)最高為circRNA_19038，其差異表達(dá)倍數(shù)為4.70倍。見表2～3。

表2 差異表達(dá)上調(diào)倍數(shù)最高的前10條circ RNA

2.4 circ RNA-miRNA共表達(dá)分析

通過miRNA靶預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)circRNA和miRNA相互作用的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果顯示多個(gè)circRNA可調(diào)節(jié)多個(gè)目標(biāo)miRNA，其中1個(gè)circRNA可作用數(shù)個(gè)miRNA，也可見多個(gè)circRNA作用1個(gè)miRNA。顯著差異表達(dá)4倍及以上的circRNA及其結(jié)合的miRNA見表4。

表3 差異表達(dá)下調(diào)倍數(shù)最高的前10條circ RNA

表4 差異表達(dá)4倍及以上的circ RNA及其結(jié)合的miRNA

3 討論

目前全球每年有1 200～1 600萬嬰兒早產(chǎn)，已成為嚴(yán)重的世界公共衛(wèi)生問題［13］。我國(guó)是當(dāng)今世界早產(chǎn)發(fā)生的第二大國(guó)，每年早產(chǎn)兒約110～150萬，其中早產(chǎn)引發(fā)的腦發(fā)育異常和損傷發(fā)生率較高，約40%～50%幸存者存在運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知等近遠(yuǎn)期后遺癥，嚴(yán)重影響早產(chǎn)兒的生長(zhǎng)和生活質(zhì)量［13-14］。因此，深入探究其調(diào)控機(jī)制，并探索有效的防治措施，已成為急需解決的重要問題。

已有研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在大量的circRNA，這些circRNA不僅與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、分化和生物學(xué)功能有密切關(guān)系，在腦損傷后神經(jīng)系統(tǒng)的病變和功能失調(diào)中也發(fā)揮重要調(diào)控作用，如circRNA參與缺血性腦卒中、阿爾茲海默癥、抑郁癥等疾病的發(fā)展與調(diào)控［15-17］。隨著研究的深入，我們發(fā)現(xiàn)circRNA的獨(dú)特結(jié)構(gòu)與功能優(yōu)勢(shì)，與線性分子相比，circRNA具有多種調(diào)控機(jī)制：（1）細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控親本基因的轉(zhuǎn)錄。（2）作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA，與mRNA競(jìng)爭(zhēng)miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，從而調(diào)控mRNA的表達(dá)。（3）可以翻譯表達(dá)有效蛋白等［9］。因此，circRNA無疑是更具有潛力的新型臨床診斷標(biāo)記物和潛在的治療靶點(diǎn)。而目前對(duì)于早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷、腦發(fā)育異常的相關(guān)circRNA研究甚少。

本研究首次采用微陣列基因芯片對(duì)炎癥誘導(dǎo)早產(chǎn)小鼠腦損傷相關(guān)的差異表達(dá)circRNA進(jìn)行分析。共篩選出365種差異表達(dá)的circRNA，其中差異表達(dá)上調(diào)有206種，差異表達(dá)下調(diào)有159種。圖2結(jié)果顯示，腦損傷早產(chǎn)鼠腦組織中的circRNA表達(dá)譜發(fā)生明顯變化，其中4個(gè)下調(diào)circRNA的差異倍數(shù)達(dá)到4倍以上，下調(diào)差異表達(dá)倍數(shù)最高為cir‐cRNA_19038，其差異表達(dá)倍數(shù)達(dá)到4.70倍。這提示我們差異表達(dá)的circRNA很可能參與了早產(chǎn)小鼠腦損傷的發(fā)展和調(diào)控過程，尤其是circRNA_19038等下調(diào)基因可能發(fā)揮更重要的調(diào)控作用，需進(jìn)一步研究其可能機(jī)制。

miRNA是一類在轉(zhuǎn)錄后通過與mRNA結(jié)合負(fù)性調(diào)節(jié)其表達(dá)的非編碼基因。有研究報(bào)道，在神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)過程中，circRNA可作為miRNA的海綿吸附體，通過結(jié)合特定的miRNA來間接調(diào)控mRNA的表達(dá)，這對(duì)于維持正常腦功能至關(guān)重要［18］。為進(jìn)一步闡明差異表達(dá)circRNA在早產(chǎn)小鼠腦損傷中的調(diào)控機(jī)制，本研究對(duì)差異表達(dá)倍數(shù)4倍以上的circRNA進(jìn)行miRNA結(jié)合預(yù)測(cè)分析并發(fā)現(xiàn)，這些變化的circRNA均有多個(gè)串聯(lián)的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合多個(gè)特定的miRNA來影響miRNA對(duì)mRNA的調(diào)控，從而影響更多的生物過程，如轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡、細(xì)胞周期、炎癥反應(yīng)等。其中，差異表達(dá)倍數(shù)最高的circRNA_19038可能通過結(jié)合miR-709、miR-669n、miR-1187、miR-574-5p和miR-466c-5p調(diào)控相關(guān)靶基因。據(jù)國(guó)外與上述miRNA相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，miR-709可通過lncRNA Mtss1的靶向調(diào)控參與并調(diào)節(jié)腦出血后繼發(fā)炎癥性腦損傷的發(fā)生與發(fā)展［19］。Li等［20］證明miR-709可通過Wnt/β-catenin通路在脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。這提示我們，circRNA_19038很可能通過結(jié)合miR-709在早產(chǎn)兒炎癥性腦損傷中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。另有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，miR-669n可能通過調(diào)控基因Vegfa參與血管新生的過程［21］。Vegfa是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中重要的調(diào)控基因，已有研究證實(shí)，Vegfa參與調(diào)節(jié)血管神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元再生及分化過程，且參與多條與炎癥反應(yīng)相關(guān)的通路［22］。本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)基因Vegfa可通過lncRNA-AK016022調(diào)控參與早產(chǎn)兒炎癥性腦損傷的發(fā)生發(fā)展［5-6］。因此，我們猜想circRNA_19038可能通過與miR-669n、miR-709的結(jié)合進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游靶基因Vegfa的表達(dá)，可將其作為下一步研究思路深入挖掘。

綜上所述，本研究證實(shí)炎癥作用使早產(chǎn)鼠腦組織中circRNA的水平發(fā)生明顯變化，并且篩選出差異表達(dá)的circRNA及相關(guān)miRNA，可以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的潛在調(diào)控點(diǎn)。本研究的局限性在于通過芯片篩選的差異表達(dá)circRNA尚未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。下一步我們將對(duì)目標(biāo)circRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步尋找其下游作用通路及其靶基因，探索與Vegfa、Wnt/β-catenin、lncRNA等已知調(diào)控基因及通路的關(guān)系，設(shè)計(jì)早期體外靶向調(diào)控目標(biāo)circRNA的可能性，為臨床提供改善早產(chǎn)兒腦損傷預(yù)后的新治療方法提供思路。