外周血cf-DNA／NETs水平在膿毒癥患者中的臨床價(jià)值研究＊

張春容，陶 武

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院急診科，重慶永川402160）

膿毒癥（sepsis）多為全身或局部感染所誘發(fā)，激活的粒細(xì)胞是清除入侵病原體執(zhí)行免疫防御的主要效應(yīng)細(xì)胞。因其病情、病因多樣且復(fù)雜，研究者們一直致力于尋找有效的生物標(biāo)志物探尋可能的發(fā)病機(jī)制[1]?，F(xiàn)有研究報(bào)道，除了殺菌蛋白外，中性粒細(xì)胞還存在第2種殺菌機(jī)制——釋放由顆粒蛋白和DNA構(gòu)成的中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（cf-DNA／NETs）[2]，但cf-DNA／NETs在sepsis患者中報(bào)道還較少。為進(jìn)一步闡述sepsis可能的機(jī)制，本研究據(jù)此設(shè)計(jì)，擬探討cf-DNA／NETs在sepsis患者中的表達(dá)及意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2014年3月至2015年1月于本院就診的sepsis患者42例（sepsis組），診斷均符合美國胸科醫(yī)師協(xié)會(huì)／美國危重癥醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)在美國華盛頓聯(lián)合會(huì)議對(duì)sepsis的診斷標(biāo)準(zhǔn)。另納入非感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征患者36例（non infection SIRS，nf-SIRS組）。納入30例健康體檢者作為對(duì)照組（control組）。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡小于18歲；妊娠狀態(tài)或哺乳期婦女；合并人類免疫缺陷病毒（HIV）感染者；惡性腫瘤者；免疫抑制（包括長期使用激素治療和放化療等）；入組24h內(nèi)死亡者；患者或家屬不同意參加此項(xiàng)研究者。對(duì)照組納入時(shí)排除1周前有發(fā)熱、咳嗽咳痰或體檢時(shí)有白細(xì)胞（WBC）升高等可疑感染征象者。3組受試者在年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。與control組比較，sepsis組和nf-SIRS組體溫顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集與檢測 于第1、3、7天7：00～9：00采集血液樣本于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管，-80℃保存待測。cf-DNA／NETs檢測同文獻(xiàn)報(bào)道，采用基于PicoGreen熒光染料的方法，采用ModulusTM單管型多功能檢測儀進(jìn)行檢測，范圍在50～3 000ng／mL[2]。將標(biāo)準(zhǔn)品小牛胸腺嘧啶DNA干粉倍比稀釋后加入PicoGreen工作液并混勻，使用ModulusTM單管型多功能檢測儀Blue熒光模塊檢測其熒光值。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度與對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度作直線回歸，并制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測血液樣本與PicoGreen工作液混勻，檢測其熒光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即求得樣本cf-DNA／NETs水平。

1.2.2 資料收集 收集3組受試者的人口學(xué)資料。收集患者各項(xiàng)臨床資料和實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果，包括體溫、影像學(xué)資料、C反應(yīng)蛋白（CRP）、降鈣素原（PCT）、WBC、中性粒細(xì)胞（N）比例等。對(duì)患者進(jìn)行急性生理及慢性健康評(píng)估（APACHEⅡ）量表檢測。

表1 3組受試者第1天各實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)比較（±s）

表1 3組受試者第1天各實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)比較（±s）

＊：P＜0.05，與control組比較；＃：P＜0.05，與nf-SIRS組比較。

組別 n CRP（mg／L）PCT（ng／mL）WBC（×109／L）N（%）cf-DNA／NETs（ng／mL）control組 30 6.2±1.6 0.01±0.05 5.4±3.7 78.4±10.4 76.2±34.7 sepsis組 42 47.2±22.4＊ 5.10±6.80＊＃ 13.4±4.6＊ 96.8±7.6＊ 1 576.0±254.0＊nf-SIRS組 36 51.8±18.9＊ 1.20±1.70＊ 11.8±5.8＊ 92.5±7.3＊ 596.0±183.0＊＃

表2 兩組患者PCT和cf-DNA／NETs在各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)情況（±s，ng／mL）

表2 兩組患者PCT和cf-DNA／NETs在各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)情況（±s，ng／mL）

＃：P＜0.05，與nf-SIRS組比較。

組別 n PCT第1天 第3天 第7天NETs第1天 第3天 第7天cf-DNA／sepsis組 42 5.1±6.8＃ 2.7±7.3＃ 0.7±1.1 1 576±254＃ 1 443±389＃ 1 389±673＃nf-SIRS組 36 1.2±1.7 0.8±0.8 0.4±0.6 596±183 582±137 474±122

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)錄入Excel表格，使用Graph pad5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較使用單因素方差分析（one-way anove）。計(jì)量資料組間比較使用Fisher確切概率法。雙側(cè)檢驗(yàn)效能，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)比較 與control組比較，sepsis組和nf-SIRS組各項(xiàng)炎癥指標(biāo)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。sepsis組PCT和cf-DNA／NETs水平顯著高于nf-SIRS組，兩組在CRP、WBC和N比例等一般感染指標(biāo)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 各組在不同時(shí)間點(diǎn)的cf-DNA／NETs表達(dá) 在入組后第1、3天，兩組患者間PCT和cf-DNA／NETs水平仍維持顯著差異狀況。而在治療后第7天，sepsis患者血漿PCT水平將至0.7ng／mL，nf-SIRS組為0.4ng／mL，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。sepsis組cf-DNA／NETs并未隨著時(shí)間的推移顯著降低，在第7天時(shí)仍維持較高水平，與nf-SIRS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3 治療7d后亞組分析 在治療后第7天，sepsis組有5例患者各項(xiàng)指標(biāo)恢復(fù)正常，考慮近日出院進(jìn)行院外隨訪（A組）。24例患者體溫恢復(fù)正常，不再發(fā)熱，但臨床癥狀提示有感染可能（B組）。另13例患者仍發(fā)熱，最低體溫高于37.8℃，細(xì)菌學(xué)檢查提示有確切的致病菌（C組）。nf-SIRS組與A組結(jié)果類似，兩組間各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與前兩組比較，B、C組cf-DNA／NETs均處于較高水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而PCT值僅在C組表現(xiàn)為顯著增高，與各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見表3。

表3 治療后7d臨床亞組分析PCT和cf-DNA／NETs表達(dá)（±s，ng／mL）

表3 治療后7d臨床亞組分析PCT和cf-DNA／NETs表達(dá)（±s，ng／mL）

a：P＜0.05，與nf-SIRS組比較；b：P＜0.05，與A組比較；c：P＜0.05，與B組比較。

36 0.40±0.60 474±122組別 n PCT cf-DNA／5 0.23±0.36 351±117 B組 24 0.52±0.65 1 462±140ab C組 13 1.34±0.73abc 1 649±216ab nf-SIRS組NETs A組

3 討論

Brinkmann等[3]首次報(bào)道炎性期激活的N能夠形成cf-DNA／NETs，其主要成分為DNA、抗菌肽與顆粒源性蛋白質(zhì)。cf-DNA／NETs結(jié)構(gòu)中富含組蛋白，包括組蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4。顆粒源性蛋白質(zhì)有嗜苯胺藍(lán)顆粒中的N彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、組織蛋白酶G，以及其他特異性顆粒蛋白質(zhì)。Pilsczek等[4]報(bào)道，N在形成NETs應(yīng)答金黃色葡萄球菌反應(yīng)時(shí)，整個(gè)過程非常迅速（5～60min）。Wartha等[5]指出，N死亡時(shí)釋放cf-DNA／NETs是一種不同于細(xì)胞凋亡或死亡的新的細(xì)胞死亡途徑，這種細(xì)胞死亡程序稱為ETosis。細(xì)胞經(jīng)ETosis表現(xiàn)為細(xì)胞核膜崩解，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)混合，細(xì)胞器消失，并在胞外形成纖維樣誘捕網(wǎng)結(jié)構(gòu)。三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的cf-DNA／NETs不僅可在病灶部位募集高濃度殺菌肽，還可利用其獨(dú)特的物理結(jié)構(gòu)阻止病原體的擴(kuò)散[6]。帶正電荷的cf-DNA／NETs組分與帶負(fù)電荷的病原體之間的電荷吸引是發(fā)生捕獲的可能機(jī)制[7]。

本研究與報(bào)道一致，在疾病早期即有cf-DNA／NETs的顯著升高。而且cf-DNA／NETs的表達(dá)有一定特異性，在感染引起的sepsis患者可高達(dá)1 576ng／mL，在非感染引起的SIRS患者僅輕度增高為596ng／mL。本研究還發(fā)現(xiàn)，cf-DNA／NETs的水平似乎和血液中WBC的數(shù)量和N比例并無相關(guān)性，因?yàn)閟epsis組和nf-SIRS組患者這兩項(xiàng)指標(biāo)差異并不明顯。雖然sepsis組和nf-SIRS組存在著是否發(fā)生感染的根本病因，但兩組患者的CRP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），能反映兩組間區(qū)別的僅為PCT和cf-DNA／NETs。進(jìn)一步分析兩組患者各時(shí)間點(diǎn)的PCT和cf-DNA／NETs表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，PCT會(huì)隨著治療不斷下降，到第7天時(shí)兩組已無顯著差異，但兩組患者此時(shí)的臨床表現(xiàn)往往差異很大，sepsis患者體內(nèi)病灶并未完全消散。治療7d后對(duì)sepsis組按療效和臨床癥狀進(jìn)行亞組分析發(fā)現(xiàn)，而cf-DNA／NETs不管是在疾病早期還是晚期，表達(dá)都較為穩(wěn)定，其水平不會(huì)隨著治療和時(shí)間改變（C組），而更多的是與機(jī)體的感染情況相關(guān)（B組），較PCT更能客觀地反映患者機(jī)體內(nèi)抗菌水平。對(duì)于與nf-SIRS患者表現(xiàn)類似的B組患者，雖然體溫恢復(fù)正常，PCT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但臨床高度懷疑仍有殘留的感染灶，持續(xù)高水平的cf-DNA／NETs是有力證據(jù)。對(duì)于后期sepsis患者，B組患者依靠常規(guī)指標(biāo)難以與nf-SIRS患者區(qū)分出來，是進(jìn)行cf-DNA／NETs檢測的主要受益者。

CRP是肝臟細(xì)胞在IL-6作用下分泌產(chǎn)生的一種急性時(shí)相蛋白，在應(yīng)激情況下增高。張敏等[8]報(bào)道以nf-SIRS為對(duì)照，CRP具有一定早期診斷sepsis的價(jià)值，這與本報(bào)道有出入的地方，可能是因?yàn)榧{入的患者存在人群差異。sepsis患者有病情輕重的差異，患者分層分布的差異可能是造成這種結(jié)果的重要原因。有研究報(bào)道，PCT有對(duì)于早期診斷sepsis和判斷病情輕重有較好的價(jià)值，診斷的特異性和敏感性分別為80%和76%[9]。但研究者多局限于早期觀察PCT的診斷價(jià)值，并未對(duì)PCT的變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)隨訪。本研究拉長了觀察時(shí)間，發(fā)現(xiàn)隨著藥物的應(yīng)用，PCT已不能準(zhǔn)確反映患者后期的狀態(tài)。對(duì)于此時(shí)的綜合評(píng)估，cf-DNA／NETs更客觀恰當(dāng)。

cf-DNA／NETs是與機(jī)體感染更密切相關(guān)的指標(biāo)。因?yàn)閏f-DNA／NETs是由多種細(xì)菌及其組分LPS刺激粒細(xì)胞活化產(chǎn)生，且機(jī)體接受整個(gè)病原體的刺激要比其單一組分如LPS的刺激能生成更多的NETs[10]。目前研究發(fā)現(xiàn)，NETs多在有病原體入侵的感染部位發(fā)生。L?gters等[11]通過研究關(guān)節(jié)滑液中cf-DNA／NETs水平與膿毒性關(guān)節(jié)炎的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)膿毒性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑液cf-DNA／NETs水平比非感染性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎患者顯著升高。因?yàn)镈NA是NETs的主要構(gòu)成成分，NETs可因DNA酶而非蛋白酶的作用水解。以rhDNase干預(yù)可阻礙機(jī)體的早期免疫反應(yīng)，加重多種微生物引起的敗血癥病理改變[12]。

綜上所述，cf-DNA／NETs和PCT一樣，不僅在早期診斷sepsis方面有一定價(jià)值，而且在后期辨別sepsis與nf-SIRS方面更優(yōu)于PCT。在sepsis病程全期，均可以cf-DNA／NETs表達(dá)情況來評(píng)估患者感染情況，指導(dǎo)臨床治療。

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