Slit2蛋白對TNF-α誘導的大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞增殖遷移的影響

劉麗華，劉 濤，王浩宇，陳桂秀，倪 偉，鄧學云

（1.川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院／四川省南充市中心醫(yī)院：1.老年病科；2.心內科；3.神經(jīng)外科 637000）

平滑肌細胞從血管中膜遷移到內膜、增殖并分泌大量的細胞外基質在動脈粥樣硬化和血管成形術后再狹窄中有重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)Slit家族成員之一Slit2蛋白能阻止血小板源性生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）誘導的人主動脈平滑肌細胞（vascular smooth musle cells，HASMCs）遷移[2]。TNF-α與PDGF同屬炎性反應產(chǎn)物，在促進平滑肌細胞遷移的過程中，二者能激活共同的、互補的信號傳導機制[3]，且在腫瘤細胞中TNF-α能引起Slit2蛋白表達增加[4-5]。因此作者推測Slit2對TNF-α在VSMCs上的作用可能有影響，并通過本研究進行論證。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞由川北醫(yī)學院組織工程干細胞研究所自行培養(yǎng)；DMEM培養(yǎng)液／高糖、胎牛血清（FBS）購自Hyclone公司，0.25%胰蛋白酶購自Invitrogen公司，青霉素、鏈霉素混合液購自KeyGEN公司，TNF-α、重組大鼠Slit2購自R＆D公司，CCK-8溶液購自碧云天公司。倒置熒光顯微鏡（Nikon公司），自動酶標儀（Anthos公司），transwell小室（Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 Slit2對血管平滑肌細胞增殖遷移的影響 （1）取對數(shù)生長期的VSMCs，以濃度2×104／mL接種于96孔板，每孔100μL培養(yǎng)基，放入5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞的貼壁融合率達80%左右時，吸棄培養(yǎng)基。實驗分為正常對照組和實驗組，正常對照組含有20%FBS的DMEM培養(yǎng)液；實驗組含有20%FBS的DMEM培養(yǎng)液及Slit2蛋白，使Slit2蛋白的濃度分別為50、75、100、125、150ng／mL。每組設6個復孔，孵育24 h，實驗終止前1h每孔加入10μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1h后，在450nm波長處測定OD值。（2）取對數(shù)生長期的VSMCs以濃度1×104／孔的細胞懸液接種到transwel小室上室，向transwel小室下室24孔板中加入含Slit2蛋白的培養(yǎng)基800μL分為正常對照組和實驗組，正常對照組含有20%FBS的DMEM培養(yǎng)液；實驗組含有20%FBS的DMEM培養(yǎng)液及Slit2蛋白，使Slit2蛋白的濃度分別為50、75、100、125、150ng／mL。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，使細胞遷移至基底膜下；取出小室，用棉簽將濾膜上表面未遷移過去的細胞拭去，晾干小室，甲醇固定，0.1%結晶紫染色，倒置顯微鏡下計數(shù)濾膜下細胞數(shù)目（×200）。每張基底膜選取9個視野。

1.2.2 Slit2對TNF-α誘導的血管平滑肌細胞增殖遷移的影響 實驗分為正常對照組、陽性對照組和實驗組，正常對照組不含TNF-α及Slit2蛋白；陽性對照組含TNF-α10ng／mL；實驗組分別含TNF-α10ng／mL＋Slit2 50ng／mL，TNF-α10ng／mL＋Slit2 75ng／mL，TNF-α10ng／mL＋Slit2 100ng／mL，TNF-α10ng／mL＋Slit2 125ng／mL，TNF-α10ng／mL＋Slit2 150ng／mL。按照上述方法分別進行增殖及遷移實驗。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，多組間變量的差異使用單因素方差分析，組間比較用LSD和SNK法，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Slit2對VSMCs增殖遷移的影響 對數(shù)生長期的VSMCs，加入不同濃度的Slit2后，采用CCK-8法檢測細胞增殖變化，分光光度計測得各組OD值變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.516），見圖1；transwel結果顯示各實驗組與對照組細胞遷移數(shù)目比較差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.52），見圖2。提示在24h內Slit2蛋白（50～150ng／mL）對VSMCs增殖遷移均沒有明顯作用。

圖1 Slit2對VSMCs增殖的影響

2.2 Slit2對TNF-α誘導的VSMCs增殖遷移的影響 實驗組和陽性對照組的OD值與正常對照組的OD值比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而實驗組與陽性對照組的OD值比較差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.173），提示Slit2對10ng／mL TNF-α誘導的VSMCs增殖沒有明顯作用。transwel結果顯示實驗組細胞數(shù)目較陽性對照組細胞數(shù)目明顯減少。提示Slit2（50～150ng／mL）能抑制10ng／mL TNF-α誘導的VSMCs遷移，且其抑制作用有濃度依賴性，濃度越大，抑制作用越明顯，當Slit2濃度達125ng／mL時其抑制作用隨濃度增加變化不再明顯，見圖3～5。

圖2 Slit2對VSMCs遷移的影響（±s，個，n＝9）

圖3 Slit2對TNF-α誘導的VSMCs增殖的影響

圖4 Slit2對TNF-α誘導的VSMCs遷移的影響

圖5 Slit2對平滑肌細胞遷移的影響（×200）

3 討論

Slit-Robo信號通路能調控神經(jīng)軸突導向、神經(jīng)元遷移及白細胞趨化，還能調節(jié)內皮細胞及心內膜細胞的遷移，影響管腔形成及血管重建[6-7]。在前期實驗中，作者在VSMCs上檢測到了Slit2的表達，且在TNF-α作用下Slit2的表達有變化，提示Slit2蛋白在VSMCs上可能有一定的作用。于是作者對Slit2蛋白在VSMCs上作用進行研究。研究結果顯示：加入不同濃度的Slit2蛋白后各組細胞的OD值與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示Slit2對VSMCs的增殖沒有明顯作用。且在10ng／mL TNF-α作用下，實驗組OD值與10 ng／mL TNF-α組比較，差異仍無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Liu等[2]通過細胞對胸腺嘧啶的攝入量來檢測DNA合成，結果顯示無論在有無PDGF狀態(tài)下，Slit2-N／1118對VSMCs的增殖均沒有影響，與本研究結果一致。遷移實驗中本研究觀察到加入Slit2蛋后，細胞遷移數(shù)目與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示Slit2蛋白對VSMCs遷移沒有明顯作用。但10ng／mL TNF-α＋Slit2組的細胞遷移數(shù)目比10ng／mL TNF-α組明顯減少，且表現(xiàn)出濃度依賴的特點，提示Slit2抑制了TNF-α誘導的細胞遷移。Ning等[8]在報道通過劃痕法及改良Boyden小室法觀察Slit2蛋白對氣管平滑肌細胞的影響，發(fā)現(xiàn)在沒有PDGF的狀態(tài)下，Slit2蛋白對細胞遷移沒有明顯作用；但當加入PDGF后，Slit2對PDGF誘導的平滑肌細胞遷移表現(xiàn)出抑制效應。Liu等[2]也通過transwell小室法發(fā)現(xiàn)在沒有PDGF的狀態(tài)下外源性Slit2蛋白對VSMCs遷移沒有影響；加入PDGF后，細胞板狀偽足形成，細胞胞體延長，應力纖維減少甚至消失，細胞遷移增加；而Slit2-N／1118阻止板狀偽足的形成，使細胞恢復到富含應力纖維的不規(guī)則形態(tài)，最終抑制了PDGF誘導的VSMCs的遷移[2，8]。本研究發(fā)現(xiàn)，Slit2能抑制TNF-α引起的內皮細胞通透性的改變[9]，從而抑制炎性反應。而TNF-α與PDGF均是炎性反應的產(chǎn)物，Slit2對TNF-α和PDGF作用下的VSMCs的作用表明：Slit2可能通過血管平滑肌細胞對血管炎性反應產(chǎn)生一定的作用。

細胞遷移是細胞骨架發(fā)生的協(xié)調性重建活動，包括機動蛋白聚合，粘著斑形成，肌動球蛋白收縮等復雜過程。而平滑肌細胞遷移的重要信號通路及效應蛋白有小G蛋白，磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinases，PI3-K），Rho活化蛋白激酶（Rho activated protein kinase，ROCK），p21活化蛋白激酶（p21-activated protein kinases，PAK）[10]，Src家族酪氨酸激酶（Src family tyrosine kinases）和促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）等[11]。關于Slit2蛋白對VSMCs遷移的具體作用環(huán)節(jié)及效應蛋白目前還不清楚，仍需進一步研究。

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