腺病毒介導的白細胞介素-10治療自身免疫性內(nèi)耳病的實驗研究△

蔡文君譚長強

1東南大學附屬中大醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(南京　210000) ; 2南京市鼓樓醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

腺病毒介導的白細胞介素-10治療自身免疫性內(nèi)耳病的實驗研究△

蔡文君1譚長強2

1東南大學附屬中大醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(南京210000) ; 2南京市鼓樓醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

【摘要】目的研究以重組復制缺陷型腺病毒為載體的白細胞介素-10(IL-10)對豚鼠自身免疫性內(nèi)耳病的治療作用。方法采用同種內(nèi)耳組織抗原加弗氏佐劑免疫豚鼠，制作自身免疫性內(nèi)耳病動物模型20只，隨機分為3組，采用圓窗膜微量注射的方式，A組(10只)注入攜帶IL-10因子的重組腺病毒(Ad-IL-10)，B組(5只)注入等量的攜帶黃色熒光蛋白標記的腺病毒(Ad-EYFP)，C組(5只)注入等量人工外淋巴液(對照組)，7天后行ABR測試，然后取豚鼠耳蝸制做石蠟切片，行HE染色和光鏡觀察，并行免疫熒光和酶免疫組織化學試驗，檢測豚鼠內(nèi)耳基因產(chǎn)物IL-10表達。結(jié)果免疫組化顯示攜帶IL-10的腺病毒可以轉(zhuǎn)染耳蝸血管紋、螺旋韌帶、Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)、蝸軸小血管周圍及其耳蝸的骨壁等部位的細胞，并產(chǎn)生相應的蛋白產(chǎn)物(IL-10)。造模后各組豚鼠ABR反應閾較造模前升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，內(nèi)耳注射后A組ABR反應閾明顯低于B組和C組。光鏡檢查示A組內(nèi)耳組織的免疫炎性反應亦明顯較B組和C組輕。結(jié)論腺病毒可以攜帶IL-10因子轉(zhuǎn)導入豚鼠內(nèi)耳，并在內(nèi)耳表達基因產(chǎn)物，可在一定程度上減輕內(nèi)耳組織免疫炎性損傷和聽損傷。

【關(guān)鍵詞】白細胞介素-10;自身免疫性內(nèi)耳病;腺病毒

△國家自然科學基金項目(30471876)資助

自身免疫性內(nèi)耳病(autoimmune inner ear disease，AIED)是一獨立的疾病，臨床表現(xiàn)為快速進行性雙側(cè)感音神經(jīng)性聽力損失，對糖皮質(zhì)激素治療有效［1］，其發(fā)病機制仍不清楚，臨床缺乏特異敏感的診斷方法。然而，應用激素治療該病亦存在一些問題，如:藥物副作用多，部分患者不能耐受，停藥后復發(fā)率較高等?；蛑委煘榻鉀Q這一難題帶來了希望，且內(nèi)耳獨特的解剖結(jié)構(gòu)也非常適合基因治療。1996年Raphael已成功應用復制缺陷型腺病毒將目的基因轉(zhuǎn)染入豚鼠的內(nèi)耳細胞［2］。此后國內(nèi)外學者在載體構(gòu)建、治療因子選擇、給藥途徑等方面做了大量研究，結(jié)果顯示腺病毒可作為載體攜帶治療因子導入動物耳內(nèi)，在動物內(nèi)耳獲得高效表達，產(chǎn)生具有生物活性的基因產(chǎn)物［3～5］。

白細胞介素-10(IL-10)是一種具有多向調(diào)節(jié)功能的細胞因子，在對自身反應性T細胞的穩(wěn)恒調(diào)節(jié)中起著重要作用，與多種免疫疾病的發(fā)生有關(guān)。實驗表明IL-10等免疫調(diào)節(jié)分子在自身免疫性疾病的預防和類風濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、自身免疫性甲狀腺炎及自身免疫性眼葡萄膜炎等動物模型的基因治療中取得了良好的效果［6，7］。Zhou等［8］研究發(fā)現(xiàn)補充外源性IL-10可以提高實驗性自身免疫性耳聾動物的聽力水平，從而表明IL-10可通過抑制Th1型細胞的促炎癥反應調(diào)節(jié)自身免疫反應的嚴重程度。本實驗在既往的研究基礎(chǔ)上，通過圓窗膜注射途徑對豚鼠自身免疫性內(nèi)耳病動物模型應用腺病毒介導的IL-10進行調(diào)節(jié)基因的試驗性治療，以探索其治療效果，報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康成熟白色紅目豚鼠55只，雌性，體重300克左右，耳廓反應正常，耳鏡檢查排除中耳疾病。

1.2內(nèi)耳組織粗制抗原制備(crude inner ear antigens，CIEAgs)選取30只豚鼠制備CIEAgs，制備方法的主要步驟［9］:將豚鼠清醒斷頭，取出顳骨，快速打開聽泡，在解剖顯微鏡下分離膜迷路，包括基底膜、螺旋韌帶、膜半規(guī)管、橢圓囊和球囊(祛除耳石器)，放入0.01 mol/L(pH 7.4)的PBS中，經(jīng)研磨、凍溶、超聲粉碎、勻漿、離心(1 000 r/min，5 min)后取上清液，采用紫外分光光度計測定蛋白含量，分裝后低溫干燥制成CIEAgs干粉，保存于-80℃冰箱備用。

1.3豚鼠自身免疫性內(nèi)耳病動物模型制備選取25只豚鼠造模，首次免疫每只動物采用CIEAgs 400 mg/0.4 ml，加等量完全弗氏佐劑，注射于右后足墊; 2周后以CIEAgs 200 mg/0.4 ml加等量不完全弗氏佐劑，注射于背部多點皮下;間隔2周后，再同樣強化免疫一次。依據(jù)聽性腦干反應(ABR)波Ⅲ的閾值升高(超過免疫前全部動物均值加2倍標準差)和出現(xiàn)針對CIEAgs特異性抗體(ELISA法，波長490 nm A值超過免疫前全部動物均值加2倍標準差)，判斷為自身免疫性內(nèi)耳病(autoimmune inner ear disease，AIED)模型動物［10］。剔除動物因免疫反應死亡等因素后，最終成功構(gòu)建AIED模型豚鼠20只。

1.4重組腺病毒構(gòu)建重組復制缺陷型腺病毒(Ad5型)購自上海醫(yī)元公司，病毒滴度Ad-IL-10(病毒滴度為1.0×10E9pfu/ml)，攜帶黃色熒光蛋白的腺病毒(Ad-EYFP) (病毒滴度為1.0×10E9 pfu/ml)，無菌條件下分裝后保存于-80℃。

1.5AIED豚鼠模型分組及各組內(nèi)耳注射方法20 只AIED模型豚鼠隨機分成三組，采用圓窗膜注射方法，A組(10只)注入攜帶IL-10因子的重組腺病毒(Ad-IL-10)，B組(5只)注入攜帶黃色熒光蛋白標記的腺病毒(Ad-EYFP)，C組(對照組，5 只)注入等量人工外淋巴液。

圓窗膜注射方法:于末次免疫后2周進行。豚鼠用1%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(30 mg/kg)后，在耳廓后方作一長約3～4 cm弧形切口，顯露聽泡，用微型電鉆打開聽泡，暴露耳蝸底回，用微推進器將小兒頭皮針的針尖(針尖斜面已打磨變小)刺入圓窗膜進入鼓階，用微量注射機緩慢(1 μl/min)注入，A組給予Ad-IL-10(病毒滴度為1.0×10E9 pfu/ml) 20 μl，B組給予Ad-EYFP(病毒滴度為1.0 ×10E9 pfu/ml ) 20 μl，C組給予等量的人工外淋巴液，明膠海綿封閉圓窗膜，骨臘封閉聽泡孔，逐層縫合傷口。所有操作嚴格遵守無菌原則。

1.6觀察指標

1.6.1特異性免疫反應測試分別于免疫前和末次免疫后2周采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定CIEAgs特異性抗體，采集并分離動物血清，用100 μg/ml的CIEAgs溶液包被ELISA板，于4℃過夜并封閉，加入1: 10稀釋的豚鼠血清37℃孵育2 h，洗板4次，加入1: 2 000稀釋的SPA-HRP(辣根過氧化物酶標記的葡萄球菌蛋白A Staphylococcal protein A-HRP，SPA-HRP) 37℃孵育1 h，洗板4次，以鄰苯二胺-過氧化氫溶液為底物顯色10分鐘后用H2SO4終止顯色，在酶標儀下測定波長為490 nm的吸光度A值。

1.6.2 ABR測試各組分別于免疫前、末次免疫后2周和圓窗膜注射1周后進行ABR測試。采用聽覺誘發(fā)電位測試系統(tǒng)(美國TDT公司制造)，豚鼠頭頂冠狀縫與矢狀縫交界處插入針形電極作為測試電極，參考電極置于耳廓后方靠近乳突尖，接地電極置于對測乳突，刺激聲信號采用click聲，重復頻率為11次/分，疊加2 048次，記錄時程10 ms，記錄波Ⅲ的閾值、潛伏期和波幅。治療后ABR反應閾降低2倍標準差作為判斷治療后聽覺功能改善標準。

1.6.3內(nèi)耳光鏡觀察于圓窗膜注射1周ABR測試后進行。每組各取2只豚鼠，麻醉后斷頭，立即取出顳骨，打開聽泡，放置4%多聚甲醛固定液中，12小時后換EDTA脫鈣7～10天，修剪后流水沖洗1～2小時，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、定向包埋。耳蝸中軸切片，片厚5 μm，漂片、撈片、粘片，常規(guī)HE染色，封片，光鏡觀察。

1.6.4免疫組織化學試驗

1.6.4.1免疫熒光化學試驗B組豚鼠于圓窗膜注射1周ABR測試后處死，方法同上，取2只動物的顳骨蠟塊行耳蝸中軸切片，片厚5 μm，漂片、撈片、粘片后常規(guī)脫蠟至水，在倒置熒光顯微鏡下觀察和攝片，觀察Ad-EYFP在內(nèi)耳的表達情況，黃色熒光為陽性表達。

1.6.4.2酶免疫組織化學試驗三組豚鼠于圓窗膜注射1周ABR測試后處死(其中A組8只，B組1只，C組3只)，按上述方法獲得耳蝸切片，用胰酶(0.2%)修復抗原，其余具體步驟:正常山羊血清封閉10 min，加PBS稀釋的第一抗體(各組均加入兔抗鼠IL-10) 4℃過夜，PBS洗5 min，3次，加入HRP標記的SPA(葡萄球菌A蛋白)作為二抗，37℃孵育30 min，PBS洗5 min，3次，DAB染色，封片劑封片，光學顯微鏡觀察攝片，深棕色顆粒提示陽性表達。觀察各組目的基因表達情況，試劑購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.7統(tǒng)計學方法采用t檢驗對各組結(jié)果進行比較。

2　結(jié)果

2.1免疫前后各組動物血清CIEAgs特異性抗體水平比較由表1可見，與免疫前相比，三組動物免疫后CIEAg特異性抗體水平均較免疫前明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。免疫前和免疫后各組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1　各組免疫前后血清CIEAgs特異性抗體水平(A值，珋x±s)

2.2各組造模前后及內(nèi)耳注射后ABR檢測結(jié)果由表2可見，與免疫前相比，免疫后各組ABR反應閾均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。A組內(nèi)耳注射后ABR反應閾較內(nèi)耳抗原免疫后降低，差異有統(tǒng)計學意義(共18耳，2耳感染不計) (P＜0.05) ; B組(共9耳，1耳感染不計)和C組(共9耳，1耳感染不計)內(nèi)耳注射后ABR反應閾較內(nèi)耳抗原免疫后比較無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表2　各組免疫前后及內(nèi)耳注射后ABR反應閾(dB SPL，珋x±s)

2.3內(nèi)耳光鏡觀察結(jié)果光鏡下可見各組內(nèi)耳均出現(xiàn)免疫炎癥反應，包括: Rosenthal’s管中炎性細胞(以單個細胞為主)浸潤，螺旋神經(jīng)節(jié)細胞變少，耳蝸頂回骨壁內(nèi)及血管紋有散在的黃色含鐵血黃素顆粒，部分動物蝸管或鼓階內(nèi)可見絮狀物沉積，蝸管內(nèi)出現(xiàn)“漂浮細胞”; Corti器和血管紋未見明顯異常。A組有2只動物炎癥反應明顯較B組和C組輕，尤其是聽覺功能改善耳，僅在蝸軸血管周圍有部分單個核細胞浸潤，但螺旋神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)大致正常，Corti器和血管紋未見明顯異常;鼓階內(nèi)見部分絮狀物，但未見“漂浮細胞”(圖1)。

2.4免疫組織化學試驗結(jié)果

2.4.1免疫熒光試驗B組見明顯熒光顯示的部位主要分布于耳蝸骨壁、骨螺旋板的蝸管內(nèi)唇部、螺旋韌帶和血管紋等部位(圖2)。

2.4.2免疫組織化學A組主要顯色反應部位包括螺旋韌帶、Corti器、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)以及耳蝸的骨壁。B組和C組僅在螺旋神經(jīng)節(jié)和耳蝸骨壁有較弱的顯色(圖3)。

圖1　各組的耳蝸縱軸切片光鏡觀察結(jié)果

圖2　B組螺旋神經(jīng)節(jié)縱軸切片免疫熒光染色結(jié)果

圖3　各組耳蝸縱軸切片免疫組織化學染色結(jié)果

3　討論

AIED的發(fā)病機制不明，但對許多自身免疫性疾病的發(fā)生和病理變化研究中發(fā)現(xiàn)，部分細胞因子起著重要作用，而自身免疫性的調(diào)節(jié)則由表達抗炎細胞因子的IL-4和IL-10所介導。

基于既往研究基礎(chǔ)，本研究采用豚鼠同種內(nèi)耳抗原免疫后，依據(jù)ABR波Ⅲ反應閾值升高(超過免疫前全部動物均值加2倍標準差)和出現(xiàn)針對CIEAgs特異性抗體，成功地制成了豚鼠自身免疫性內(nèi)耳病模型［11］，通過圓窗膜途徑將重組腺病毒攜帶免疫調(diào)節(jié)因子(即Ad-IL-10)導入模型豚鼠內(nèi)耳，結(jié)果顯示經(jīng)內(nèi)耳局部注射Ad-IL-10后，部分實驗動物的ABR波Ⅲ閾值降低，較對照組有顯著性差異，說明其聽功能有所恢復。而單純注射腺病毒組與對照組比較聽功能未出現(xiàn)進一步損傷，說明腺病毒作為載體在動物內(nèi)耳研究中是安全可行的;但病毒載體存在的缺點如免疫原性、致瘤性及細胞毒性限制了其臨床應用研究，因此尋找更有意義的載體也是目前研究的方向。本研究中A組動物的內(nèi)耳免疫炎性反應較B組和C組動物輕，僅見部分實驗動物出現(xiàn)蝸管內(nèi)絮狀物，未出現(xiàn)螺旋神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量變化，Corti器和血管紋形態(tài)基本正常，提示導入內(nèi)耳局部的免疫調(diào)節(jié)因子IL-10調(diào)節(jié)并抑制了由于自身免疫所造成的內(nèi)耳炎性反應和損傷，這可能是A組動物聽力提高的原因所在。

本研究結(jié)果顯示，重組腺病毒可以成功轉(zhuǎn)染豚鼠內(nèi)耳，其主要分布于耳蝸骨壁、骨螺旋板的蝸管內(nèi)唇部、螺旋韌帶和血管紋等部位。IL-10基因產(chǎn)物主要分布于血管紋、螺旋韌帶、Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)以及耳蝸的骨壁，說明通過圓窗膜的單一點注射可以將治療因子轉(zhuǎn)導入并較為廣泛地分布于內(nèi)耳各部位組織中。本研究中僅極少數(shù)豚鼠出現(xiàn)了中耳感染，與鼓階注射法［12］相比較，避免了耳蝸底回破壞造成的聽損傷，該操作方法簡單易行，安全可靠。值得一提的是本研究發(fā)現(xiàn)耳蝸的骨壁均有顯著的病毒轉(zhuǎn)染和免疫調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的表達，但其具體機制尚不清楚。依據(jù)以往實驗研究中的發(fā)現(xiàn)［13］，即同種內(nèi)耳組織抗原免疫豚鼠后，部分實驗動物的耳蝸骨壁內(nèi)出現(xiàn)明顯的炎性病灶(與耳硬化癥的病變極為相似，從而支持該病的自身免疫性病因?qū)W假說)，此次轉(zhuǎn)入調(diào)節(jié)因子的治療方法是否對于自身免疫性耳硬化癥發(fā)揮一定的治療效果，有待進一步研究證實。

總之，本研究表明外源性IL-10對實驗性自身免疫性內(nèi)耳病有一定治療作用，然而細胞因子是個復雜的網(wǎng)絡，IL-10在AIED中具體調(diào)節(jié)機制還有待進一步闡明。本研究只是對該領(lǐng)域的初步探討，給藥劑量、藥物調(diào)控、遠期療效及安全性等方面等還有待進一步深入研究。相信隨著分子生物學的發(fā)展，內(nèi)耳的基因調(diào)節(jié)治療必將成為一種非常有前景的治療方法。

4參考文獻

1黃選兆，汪吉寶，孔維佳.實用耳鼻咽喉頭頸外科學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008.998～1001.

2Raphael Y，F(xiàn)risancho JC，Roessler BJ.Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo［J］.Neurosci Lett，1996，207: 137.

3 Ishimoto S，Kawamoto K，Kanzaki S，et al.Gene transfer into supporting cells of the organ of Corti［J］.Hear Res，2002，173: 187.

4 Sun H，Huang A，Cao S.Current status and prospects of gene therapy for the inner ear［J］.Hum Gene Ther，2011，22: 1311.

5郭維，胡吟燕，翟所強，等.腺病毒攜帶的LacZ基因在豚鼠耳蝸中的表達［J］.聽力學及言語疾病雜志，2001，9: 36.

6 De Kozak Y，Thillaye-Goldenberg B，Naud MC，et al.Inhibition of experimental autoimmune uveoretinitis by systemic and subconjunctival adenovirus-mediated transfer of the viral IL-10 gene ［J］.Clin Exp Immunol，2002，130: 212.

7 Liang W，Zaruhi K，Xu QH，et al.B-cell delivered gene transfer of human S-Ag-Ig fusion protein protects from experimental autoimmune uveitis［J］.Clin Immunol，2006，118: 35.

8Zhou B，Kermany MH，Cai Q，et al.Experimental autoimmune hearing loss is exacerbated in IL-10-deficient mice and reversed by IL-10 gene transfer［J］.Gene Therapy，2012，19: 228.

9譚長強，董偉達，陸玲.同種內(nèi)耳抗原免疫孕豚鼠所產(chǎn)子鼠聽覺損傷程度與母鼠特異性免疫反應水平相關(guān)性研究［J］.東南大學學報(醫(yī)學版)，2007，26: 397.

10楊湘寧，鐘啟明.同種內(nèi)耳抗原免疫致豚鼠感音神經(jīng)性聾的實驗研究［J］.中華耳鼻咽喉科雜志，1992，27: 325.

11譚長強，鐘啟明，曹銀成，等.在自身免疫性感音神經(jīng)性聾發(fā)病機理中內(nèi)淋巴囊作用的實驗研究［J］.耳鼻喉學報，1993，7: 153.

12 Iizuka T，Kanzaki S，Mochizuki H，et al.Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea［J］.Human Gene Therapy，2008，19: 384.

13譚長強.特異性體液轉(zhuǎn)移免疫致豚鼠先天性感音神經(jīng)性聾實驗研究［J］.東南大學學報(醫(yī)學版)，2007，26: 327.

(2014-12-09收稿)

(本文編輯雷培香)

·實驗研究·

Adenovirus-Mediated IL-10 Gene for the Treatment of Autoimmune Inner Ear Disease-an Experimental Study

Cai Wenjun*，Tan Changqiang
(*Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing，210000，China)

【Abstract】Objective To evaluate therapeutic effects of transferring recombinant replication-defective adenovirus vector of interleukin 10(IL-10) gene into inner ear of guinea pig for the treatment of autoimmune inner ear disease.Methods The conspecific crude inner ear antigens (CIEAgs) were prepared and used to immunize guinea pigs with Freund＇s adjuvant that resulted autoimmune inner ear diseases (AIED) in 20 animals.Then they were randomly divided into three groups.Through the way of round window membrane micro-injection，adenovirus vector containing IL-10(Ad-IL-10) gene were implanted in group A(ten animals)，recombinant adenovirus with yellow fluorescent protein(Ad-EYFP) marked was implanted in group B(five animals)，and artificial perilymph were implanted in group C(five animals).Seven days later，auditory brain-stem response (ABR) thresholds were determined，the guinea pig inner ears were obtained，and the immunohistochemistry staining were perform for detecting adenovirus vector transfection with immunofluorescence and the gene product interleukin 10 expressions with enzyme immunohistochemistry.Results Immunohistochemistry staining showed that the adenovirus carrying IL-10 gene could transfer the psalterial cord，spiral ligament，Corti organ，spiral ganglion，cochlear axis vessels and cochlear bone paries.It could generate gene product (IL-10 ) in same sites.The mean ABR thresholds were increasedbook=603,ebook=40in each group after modeling.The differences were statistically significant.After injection of the inner ear，the mean ABR thresholds of group A were lower than those of group B and group C.The light microscopic revealed the immunological inflammatory response were lighter than in group B and group C.Conclusion The adenovirus could transfer IL-10 gene into inner ear of guinea pig and express its products in many parts of inner ear.The immunity regulating gene can reduce the immunity damage and hearing functional impairment.

【Key words】Interleukin 10(IL-10) ; Autoimmune inner ear disease(AIED) ; Adenovirus

通訊作者:譚長強(Email: wenjun.cai@163.com)

作者簡介:蔡文君，女，河北人，碩士，主要研究方向為耳科學與聽力學。

【中圖分類號】R764.3

【文獻標識碼】A

【文章編號】1006-7299(2015) 06-0602-05

DOI:10.3969/j.issn.1006-7299.2015.06.009

網(wǎng)絡出版時間:2015-9-10 16: 47

網(wǎng)絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20150910.1647.028.html