白藜蘆醇通過促進自噬減輕糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的實驗研究

沈佳佳　黃瑛　祁煒罡　談晶花　張代富

(上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，上?！?01200)

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白藜蘆醇通過促進自噬減輕糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的實驗研究

沈佳佳△黃瑛△祁煒罡談晶花張代富

(上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，上海201200)

摘要目的：探討白藜蘆醇減輕糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護機制及其對心肌細(xì)胞自噬的影響。方法：用鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型，選取35只糖尿病造模成功大鼠，隨機分為假手術(shù)組、白藜蘆醇未手術(shù)組、缺血再灌注損傷模型組、白藜蘆醇治療組、白藜蘆醇+胰島素聯(lián)合治療組，每組各7只。通過結(jié)扎-放松左冠狀動脈制備缺血再灌注損傷模型。通過亞甲藍(lán)染色觀察心肌梗死面積變化；在透射電鏡下觀察自噬泡；采用蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)法檢測微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)Ⅰ和Ⅱ、自噬相關(guān)基因5(autophagy related gene 5，Atg5)、Beclin-1的表達水平及腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的表達及磷酸化水平。結(jié)果：白藜蘆醇治療組與白藜蘆醇+胰島素聯(lián)合治療組心肌梗死面積顯著小于缺血再灌注損傷模型組(P<0.05)。電鏡結(jié)果顯示，白藜蘆醇治療與白藜蘆醇+胰島素聯(lián)合治療可促進糖尿病大鼠缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞的自噬，改善心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)。缺血再灌注損傷模型組大鼠心肌細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Atg5、Beclin-1表達水平較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05)，而LC3-Ⅰ表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；白藜蘆醇治療組及白藜蘆醇+胰島素聯(lián)合治療組Atg5、Beclin-1表達水平均顯著高于缺血再灌注損傷模型組，且白藜蘆醇+胰島素聯(lián)合治療組Beclin-1表達水平高于白藜蘆醇治療組(P<0.05)；各組之間mTOR、AMPK表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但白藜蘆醇治療組及白藜蘆醇+胰島素聯(lián)合治療組AMPK磷酸化水平顯著高于缺血再灌注損傷模型組，而mTOR磷酸化水平則顯著低于缺血再灌注損傷模型組(P<0.05)。結(jié)論：白藜蘆醇可能通過激活A(yù)MPK、抑制mTOR通路，上調(diào)LC3-Ⅱ、Atg5、Beclin-1的表達，促進自噬，抑制缺血再灌注損傷，減少心肌梗死面積，從而保護糖尿病大鼠心肌細(xì)胞。

關(guān)鍵詞白藜蘆醇；糖尿病模型；缺血再灌注損傷模型；自噬；大鼠

糖尿病是心血管疾病的獨立危險因子，超過50%的糖尿病患者死于血管并發(fā)癥[1]。目前，關(guān)于強化血糖控制對糖尿病大血管并發(fā)癥的影響，各研究[2-4]結(jié)果不一，這是因為糖尿病合并血管病變極具復(fù)雜性，與高血糖、高血壓、高血脂、血液高凝狀態(tài)、炎性反應(yīng)等多種因素均有關(guān)，所以單純控制血糖并不能從根本上降低血管事件的發(fā)生率。

白藜蘆醇是一種非黃酮類的酚類物質(zhì)，天然的白藜蘆醇在很多植物中存在，這是植物為了抵御病菌入侵而產(chǎn)生的一種抗毒素。流行病學(xué)研究[5]發(fā)現(xiàn)，法國人常食牛排、奶酪等高膽固醇食品，但是其心血管病發(fā)病率僅為美國人的1/3，這歸因于美法兩國飲食習(xí)慣不同，法國人葡萄酒攝入量高。葡萄酒中所含大量的白藜蘆醇可能對心血管病具有保護作用。白藜蘆醇有抗癌、抗心血管疾病、抗糖尿病等作用。最近研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，小劑量白藜蘆醇能調(diào)節(jié)自噬，增強細(xì)胞存活信號，幫助細(xì)胞在損傷中復(fù)原，從而保護心肌。本研究旨在明確白藜蘆醇對糖尿病大鼠缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，I/R)的保護機制及其對心肌細(xì)胞自噬的影響，并探討其內(nèi)在機制，以期為臨床研究提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1實驗動物及糖尿病模型的制備選取6～8周齡、體質(zhì)量160～200 g的雄性SD大鼠45只(購自上海斯萊克實驗動物有限公司)，飼養(yǎng)在(26±2)℃空調(diào)房內(nèi)，濕度60%～80%，2～3 d換1次墊料，分籠飼養(yǎng)，給予符合上海市衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的飲用水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實驗前1 d禁食、不禁水，禁食時間不少于14 h。實驗當(dāng)天，將鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ；美國Sigma公司)用0.1 mol/L、pH 4.2 的檸檬酸鈉緩沖液在冰浴中溶解，根據(jù)大鼠的體質(zhì)量單次腹腔注射STZ溶液65 mg/kg。全部大鼠注射STZ溶液后，繼續(xù)禁食1 h，然后喂飼料，保持飲水充足。給藥后10 d內(nèi)，動物逐漸消瘦，狀態(tài)變差，精神萎靡，皮毛聳立，出現(xiàn)多飲、多食、多尿等1型糖尿病的表現(xiàn)，空腹血糖值>16.7 mmol/L。10 d后造模成功，造模成功率超過80%。

1.2實驗動物分組及處理選取35只糖尿病造模成功大鼠，每日監(jiān)測血糖。將這35只大鼠隨機分為5組，每組7只，分別為假手術(shù)組(sham組，不給藥，模擬手術(shù)狀態(tài)，但不結(jié)扎冠狀動脈)、白藜蘆醇未手術(shù)組[Resveratrol組，白藜蘆醇(購自上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)公司)2.5 mg/(kg·d)，飼養(yǎng)10 d，模擬手術(shù)狀態(tài)，但不結(jié)扎冠狀動脈]、缺血再灌注損傷模型組(I/R組，不給藥，手術(shù)結(jié)扎冠狀動脈30 min，再灌注120 min)、白藜蘆醇治療組[I/R+Resveratrol組，白藜蘆醇2.5 mg/(kg·d)，飼養(yǎng)10 d，手術(shù)結(jié)扎冠狀動脈]、白藜蘆醇+胰島素聯(lián)合治療組[I/RI+Resveratrol組，白藜蘆醇2.5 mg/(kg·d)，飼養(yǎng)10 d，皮下注射胰島素4 U/d，手術(shù)結(jié)扎冠狀動脈30 min，再灌注120 min]。白藜蘆醇的給藥方法為：溶于0.9%氯化鈉液后灌胃。手術(shù)結(jié)扎冠狀動脈30 min后，取心肌組織、切片，用0.9%氯化鈉液沖洗干凈后在0.3%亞甲藍(lán)染液中浸泡20 min，再用0.9%氯化鈉液沖洗。染色后正常組織呈藍(lán)色，梗死部位呈白色。用圖形分析軟件計算梗死面積。應(yīng)用透射電鏡觀察各組梗死區(qū)、非梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)的自噬泡。具體參考文獻[8]。

1.3蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)法檢測自噬相關(guān)蛋白的表達與腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的表達及其磷酸化水平各組取等量總蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)(電流400 mA，2 h)至聚偏氟乙烯膜，將膜浸入封閉液[在Tris-鹽酸緩沖液(TBST)中加入脫脂奶粉，至最終的質(zhì)量體積濃度為5%]，室溫下振蕩1 h。加入稀釋好的一抗抗體[微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)-Ⅰ與LC3-Ⅱ抗體，均為1∶1000，購自德國Merck Millipore公司；自噬相關(guān)基因5(autophagy related gene 5, Atg5)抗體，1∶1000，購自英國Abcam公司；Beclin抗體，1∶1000，購自英國Abcam公司；AMPK、mTOR及其磷酸化抗體稀釋度均為1∶1000，購自美國Santa Cruz公司]， 4 ℃過夜。TBST洗膜3次(每次5 min)。加入稀釋好的二抗抗體(1∶5000)，室溫1 h振蕩孵育。在電化學(xué)發(fā)光分析儀上進行電化學(xué)發(fā)光，于暗室壓X光底片曝光，顯影、定影，水洗膠片并晾干后保存。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1白藜蘆醇對糖尿病大鼠心肌梗死面積的影響相對于I/R組，I/R+Resveratrol組與I/RI+Resveratrol組大鼠的心肌梗死面積均縮小(P<0.05)，見圖1。

2.2白藜蘆醇對糖尿病大鼠I/R中自噬泡的影響透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，sham組與Resveratrol組心肌細(xì)胞核膜完整，核質(zhì)分布均勻，染色較淡，呈細(xì)粒分散狀，胞漿內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，線粒體嵴清楚，存在少量自噬泡。而I/R組心肌細(xì)胞收縮，染色質(zhì)縮合成塊狀，有的線粒體輕度腫脹、部分空泡化，無自噬泡存在；I/R+Resveratrol組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)較I/R組得到改善，核質(zhì)內(nèi)部分細(xì)胞器結(jié)構(gòu)少量修復(fù)，可見少量自噬泡存在；I/RI+Resveratrol組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)較I/R組改善明顯，線粒體等細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)清晰，亦可見少量自噬泡存在。見圖2。

與I/R組比較，*P<0.05

圖1各組大鼠心肌梗死面積的比較

圖2　透射電鏡下觀察心肌細(xì)胞的自噬泡 (標(biāo)尺=0.5 μm；箭頭指示為自噬泡)

2.3白藜蘆醇對糖尿病大鼠I/R中自噬相關(guān)蛋白的表達以及mTOR、AMPK的表達和磷酸化的影響與Sham組比較，I/R組大鼠心肌細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Atg5、Beclin-1表達水平明顯降低(P<0.05)，LC3-Ⅰ的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；I/R+Resveratrol組及I/RI+Resveratrol組Atg5、Beclin-1表達水平顯著高于I/R組，且I/RI+Resveratrol組Beclin-1表達水平高于I/R+Resveratrol組。此外，各組間mTOR、AMPK表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，I/R+Resveratrol組及I/RI+Resveratrol組p-AMPK表達水平顯著高于I/R組，而p-mTOR表達水平則顯著低于I/R組。見圖3。

與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05

圖3各組大鼠心肌組織中自噬相關(guān)蛋白的表達及AMPK、mTOR的表達及其磷酸化水平的檢測

[內(nèi)參照為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)]

3討論

自噬是指細(xì)胞通過單層或雙層膜包裹細(xì)胞質(zhì)中的大分子物質(zhì)(比如蛋白質(zhì)、RNA、糖原等)和一些細(xì)胞的內(nèi)源性底物(包括由于生理或病理原因引起的衰老、破損的細(xì)胞器)而形成自噬體，再轉(zhuǎn)運到溶酶體形成自噬溶酶體進而被降解利用的過程。在應(yīng)激、營養(yǎng)缺乏、低氧狀態(tài)下，自噬降解的分子和細(xì)胞器可為細(xì)胞內(nèi)提供能量和合成蛋白質(zhì)的氨基酸，是營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下的一種保護機制。近期研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能調(diào)節(jié)自噬，增強細(xì)胞存活信號，幫助細(xì)胞在損傷中復(fù)原，從而保護心肌。本研究結(jié)果顯示，I/R+Resveratrol組及I/RI+Resveratrol組心肌梗死面積都較I/R組顯著減小。電鏡結(jié)果也顯示，I/R+Resveratrol組及I/RI+Resveratrol組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)較I/R組改善，核質(zhì)內(nèi)部分細(xì)胞器結(jié)構(gòu)得到修復(fù)，2組心肌細(xì)胞內(nèi)均可見少量自噬泡。這表明，白藜蘆醇能上調(diào)自噬，減輕糖尿病大鼠I/R，減少心肌梗死面積，保護心肌。

自噬的啟動依賴于一系列自噬相關(guān)基因(Atg)的參與，目前發(fā)現(xiàn)的Atg有30余種[9]。自噬誘發(fā)后，Atg5可促使自噬體膜的形成和延長，形成自噬體結(jié)構(gòu)[10]。在自噬的整個過程中，自噬體的形成是關(guān)鍵。Beclin 1是一個關(guān)鍵的自噬調(diào)控分子，能與VPS34形成復(fù)合物，引發(fā)自噬相關(guān)蛋白在兩大泛素系統(tǒng)中的募集并結(jié)合于前自噬結(jié)構(gòu)(pre-autophagosomal structure，PAS)膜上，促使PAS膜呈“C”型延伸，包裹待降解的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器等，形成自噬體結(jié)構(gòu)[11]。另外，LC3能與Atg一起，促進自噬體成熟。本研究發(fā)現(xiàn)，I/R+Resveratrol組及I/RI+Resveratrol組的Atg5、Beclin-1含量均顯著高于I/R組；白藜蘆醇治療能增加糖尿病大鼠IR時的Atg5、Beclin-1含量，促進自噬體形成、上調(diào)自噬。此外，白藜蘆醇和胰島素聯(lián)合治療較單用白藜蘆醇能進一步上調(diào)Beclin-1的表達。

AMPK是一種Ser/Thr蛋白激酶，為異源三聚體蛋白，由1個催化亞基α和2個調(diào)節(jié)亞基β、γ組成，是能量代謝和自噬、凋亡調(diào)控中的重要分子[12]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP水平較低時，AMP和ADP直接結(jié)合γ亞基，構(gòu)象改變，使AMPK磷酸化[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，I/R+Resveratrol組及I/RI+Resveratrol組p-AMPK表達水平顯著高于I/R組，而p-mTOR表達水平則顯著降低；這表明，在I/R時，白藜蘆醇可活化糖尿病大鼠的AMPK通路、抑制mTOR通路。這與國外其他研究[15-17]結(jié)果一致。

綜上所述，白藜蘆醇可能通過激活A(yù)MPK通路和抑制mTOR通路，上調(diào)LC3-Ⅱ、Atg5、Beclin-1的表達，促進自噬，從而減輕糖尿病大鼠I/R。然而，其內(nèi)在調(diào)控機制仍有待進一步探究。

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Resveratrol Reduces Cardiac Ischemia-Reperfusion Injury of Diabetic Rats by Promoting Autophagy in Experimental Study

SHENJiajia△HUANGYing△QIWeigangTANJinghuaZHANGDaifu

DepartmentofCardiology,ShanghaiPudongNewAreaPeople’sHospital,Shanghai201200,China

AbstractObjective： To investigate the protective mechanism of resveratrol in reducing cardiac ischemia-reperfusion injury (I/R) of diabetic rats and its effect on autophagy of cardiomyocytes.Methods： Streptozotocin(STZ)-induced diabetic rat model was constructed and 35 diabetic model rats were randomly divided into five groups, the sham group, the resveratrol non-surgery group, the I/R group, the resveratrol treatment group, and the resveratrol+insulin group, with 7 rats in each. Then I/R model was built by ligating-relaxing the left coronary. The change of myocardial infarction size was observed by methylene blue staining. Autophagic vacuoles were observed with transmission electron microscope(TEM). The expression of microtubule-associated protein 1 light chain 3(LC3)-Ⅰ and Ⅱ, autophagy related gene 5(Atg5), Beclin-1, as well as the expression and phosphorylation levels of AMP-activated protein kinase(AMPK) and mammalian target of rapamycin(mTOR), were detected by Western blotting.Results： The infarction size in resveratrol treatment group and resveratrol+insulin group was significantly smaller than that in I/R group(P<0.05).TEM showed that in resveratrol treatment group and resveratrol+insulin group, autophagy of cardiomyocytes could be promoted and the structure of cardiomyocytes could be improved, when I/R of occurred. The expression levels of LC3-Ⅱ,Atg5,Beclin-1 in I/R group were significantly lower than those in sham group(P<0.05),whereas the change of expression levels of LC3-Ⅰ had no significant difference(P>0.05). Meanwhile, the expression levels of Atg5 and Beclin-1 in resveratrol treatment group and resveratrol+insulin group were significantly higher than those in I/R group, and the expression level of Beclin-1 in resveratrol+insulin group was higher than that in resveratrol treatment group(P<0.05). There was no significant difference in the expression level of AMPK and mTOR among the 5 groups(P>0.05). However, the expression level of p-AMPK was significantly higher in resveratrol treatment group and resveratrol+insulin group than that in I/R group, and the expression level of p-mTOR was significantly lower in resveratrol treatment group and resveratrol+insulin group than that in I/R group (P<0.05).Conclusions： Resveratrol may protect cardiomyocytes of diabetic rats by activating AMPK pathway, inhibiting mTOR pathway, increasing the expression of LC3-Ⅱ,Atg5 and Beclin-1, promoting autophagy, suppressing I/R, and reducing infarction size.

Key WordsResveratrol；Diabetic model；Ischemia-reperfusion injury model；Autophagy；Rats

中圖分類號R587.1

文獻標(biāo)識碼A

通訊作者張代富，E-mail：zdf@medmail.com.cn

基本項目：上海市衛(wèi)生局青年科研項目(編號：20124Y200)

△沈佳佳和黃瑛對本文有同等貢獻，為共同第一作者

·論著·