四川西部瀕危植物桃兒七遺傳多樣性的RAPD分析

肖 猛, 李 群, 郭 亮, 唐 琳, 王 麗, 陳 放,*

1 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 成都 610064 2 四川旅游學(xué)院, 成都 610100 3 四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 成都 610066

四川西部瀕危植物桃兒七遺傳多樣性的RAPD分析

肖 猛1,2, 李 群1,3, 郭 亮1, 唐 琳1, 王 麗1, 陳 放1,*

1 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 成都 610064 2 四川旅游學(xué)院, 成都 610100 3 四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 成都 610066

桃兒七是一種具有重要藥用價值的珍稀瀕危植物。采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，對在四川西部地區(qū)的桃兒七7個自然種群的遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。用12個RAPD引物對7個種群共140個樣品進(jìn)行了擴增，共得到111條清晰帶，其中32條具有多態(tài)性，在物種水平上多態(tài)位點百分率(PPB)為28.83%，在種群內(nèi)的多態(tài)位點百分率變動幅度為4.50%至16.22%。同其它一些瀕危植物相比，桃兒七種群具有較低的遺傳多樣性(He=0.0622，Ho=0.0987)。7個自然種群間出現(xiàn)了很強的遺傳分化，分化指數(shù)接近70%。種群間的基因流低(Nm=0.2240)。造成上述結(jié)果的可能原因是與桃兒七的繁育方式和有限的基因流等因素有關(guān)。應(yīng)將遺傳多樣性相對較高的松潘縣牟尼溝種群作為原位保護(hù)的核心種群進(jìn)行保護(hù)，盡量保護(hù)所有現(xiàn)有種群。

桃兒七; RAPD; 遺傳多樣性; 遺傳結(jié)構(gòu); 保護(hù)策略

桃兒七(Sinopodophyllumhexandrum(Royle) Ying；分類學(xué)上的同種異名有S.emodi(Wall) Ying，PodophyllumhexandrumRoyle，P.emodiWall；又名西藏鬼臼)是小檗科桃兒七屬單一種的多年生草本植物[1]。桃兒七主要生長在喜馬拉雅及臨近地區(qū)。在我國，主要分布在海拔2700到4500 m的西藏、四川、云南等高山地區(qū)，其他的省(自治區(qū))如陜西、甘肅、青海、寧夏以及湖北亦有分布。據(jù)調(diào)查，桃兒七在四川省主要分布于阿壩州、甘孜州以及涼山州木里縣等地。桃兒七是一種傳統(tǒng)的民間藥用植物，其根和根莖中的主要成分之一鬼臼毒素(podophyllotoxin)是人工合成抗癌藥物(VP16，依托泊苷；VM26，特尼泊苷)的前體[2]。桃兒七也是一種葉奇、花美、果實具有多種用途的植物[3]。近年來由于人類砍伐等干擾活動加劇，桃兒七生境受到破壞，加上根莖可入藥，采挖過量，致使種群數(shù)量迅速減少，已被國家列為珍稀瀕危保護(hù)植物[4]。因此，很有必要進(jìn)行桃兒七保護(hù)遺傳學(xué)研究，探討它的瀕危機制。有關(guān)桃兒七遺傳多樣性研究，先前的工作僅在細(xì)胞學(xué)有關(guān)核型研究方面的報道[5- 6]。然而，細(xì)胞學(xué)研究觀察到的植物信息量非常有限，要想更深入地了解桃兒七的遺傳多樣性，必須對其進(jìn)行更深層次(如DNA水平)的遺傳多樣性研究。目前,這方面的研究在國內(nèi)外僅見少量報道[7- 9].

在研究植物多樣性的眾多分子標(biāo)記技術(shù)中，RAPD(Random amplified polymorphic DNA)是應(yīng)用最廣泛的技術(shù)方法之一。RAPD標(biāo)記是以一段隨機寡核苷酸序列為引物(長度一般為10 bp)、以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴增的一種分子標(biāo)記技術(shù)[10]。該技術(shù)具有簡單易行、不需要事先知道材料的基因信息、能夠覆蓋整個基因組以及顯性遺傳標(biāo)記等特點，且從理論上RAPD可提供的信息量是無限的。目前，RAPD標(biāo)記在重要作物林木遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位與分離、種質(zhì)資源評估、栽培植物品種鑒定、野生植物天然種群的遺傳結(jié)構(gòu)分析以及種間或?qū)匍g遺傳關(guān)系分析等領(lǐng)域的研究已有大量報道[11]。近年來，應(yīng)用RAPD技術(shù)在種群水平上進(jìn)行瀕危植物保護(hù)生物學(xué)的研究已取得顯著的進(jìn)展，主要是揭示瀕危物種的遺傳多樣性，探討瀕危機理，提出保護(hù)策略建議。目前在國內(nèi)應(yīng)用RAPD技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性研究所涉及的瀕危植物如長葉紅砂Reaumuriatrigyna[12]，崖柏Thujasutchuenensi[13]，明黨參Changiumsmyrnioides[14]、水杉Metasequoiaglyptostroboides[15]、版納青梅Vaticaguangxiensis[16]、華木蓮Sinomanglietiaglauca[17]、閩楠Phoebebournei[18]、銀杉Cathayaargyrophylla[19]、五針白皮松Pinussquamata[20]等。本文選用了RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對川西高原地區(qū)桃兒七分布較多的5個地區(qū)7個野生種群的遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測，旨在揭示桃兒七自然種群的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性水平,從分子水平上探討它的瀕危機制,為有效保護(hù)桃兒七遺傳資源提供科學(xué)依據(jù)。

圖1 桃兒七7個自然種群的地理位置 Fig.1 Location of the seven natural population of Sinopodophyllum hexandrum included in this study

1 材料與方法

1.1 實驗材料

根據(jù)四川大學(xué)植物標(biāo)本館的文獻(xiàn)記載和野外實地調(diào)查桃兒七的分布情況，于5月下旬至6月下旬在桃兒七分布較多的四川省西部高原地區(qū)采集了7個種群(最遠(yuǎn)的兩種群間直線距離為567.5 km，最近的兩種群距離為12.5 km)、合計140份材料的樣品。7個種群在四川西部的分布見圖1。各種群所在地及生境狀況見表1。在每個桃兒七種群中隨機選取20個具有代表性的樣株,每個樣株間隔距離5 m以上,每株采集的幼嫩葉片迅速裝入自封袋中并用硅膠干燥保存，用于總基因組DNA的提取。

表1 7個種群桃兒七的產(chǎn)地、生境及采樣個體數(shù)Table 1 Location, habitat and sample size of seven of Sinopodophyllum hexandrum Populations

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 提取與RAPD的PCR擴增

采用改進(jìn)的改良CTAB法[11]提取桃兒七基因組總DNA。總DNA溶于0．1×TE緩沖液,分裝后放入-20 ℃儲存或放入4 ℃待用。采用來自O(shè)peron公司(且本實驗室現(xiàn)有)及根據(jù)相關(guān)資料設(shè)計并由上海生工公司合成的10堿基RAPD引物(120條)，從中篩選出12條具多態(tài)性和穩(wěn)定性的引物在PTC- 100TM中進(jìn)行擴增。在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上經(jīng)過比較和優(yōu)化確定20 μL反應(yīng)體系為：1×PCR buffer(10 mmol/L Tris-HCl，pH值8.3，50 mmol/L/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2)，模板10—30 ng、1 UTaq聚合酶、0.4 mmol/L dNTPs、0.6 μmol/L引物、37 ℃的退火溫度、0.001%的白明膠。PCR擴增條件:94 ℃預(yù)變性5 min,37 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，然后進(jìn)行40個循環(huán):94 ℃變性1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在含0.5% EB的1.5% 瓊脂糖凝膠中以1×TAE緩沖液為介質(zhì)電泳，以100 bp Marker作為標(biāo)準(zhǔn)分子量對照，在Gene genius Bioimaging System凝膠成像儀上照相。

1.2.2 統(tǒng)計分析

RAPD擴增產(chǎn)物電泳圖譜中的每一條帶均視為一個分子標(biāo)記(marker)，代表一個引物的結(jié)合位點。按凝膠同一位置上DNA帶的有無進(jìn)行統(tǒng)計，有帶(包括弱帶)的記為“1”，無帶的記為“0”的格式輸入構(gòu)成的RAPD表型數(shù)據(jù)矩陣用于分析。采用POPGENE 1.31 軟件對全部種群和各個單種群分別進(jìn)行遺傳參數(shù)分析[21],分別計算了多態(tài)位點百分率(PPB)、觀測等位遺傳標(biāo)記數(shù)(Ao)、有效等位遺傳標(biāo)記數(shù)(Ae)、種群總遺傳多樣性(Ht)、種群內(nèi)遺傳多樣性(Hs)、各種群間的遺傳分化指數(shù)(Gst)、基因流(Nm)、Nei′s基因多樣性(He)，Nei′s遺傳一致度(I)和遺傳距離(D)。Shannon′s信息指數(shù)(Ho)也被用來檢測種群遺傳多樣性水平。Ho=-∑Pilog2Pi，Pi為第i條帶的表型頻率。根據(jù)Nei′s遺傳距離，按不加權(quán)成對算術(shù)平均法(UPGMA)建立系統(tǒng)聚類分枝樹狀圖。另外,分子方差分析方法(AMOVA)也被用來分析種群間和種群內(nèi)的分子變異[22]。

為了檢測種群間遺傳距離和地理距離的相關(guān)性,運用TFPGA1.3程序軟件[23]進(jìn)行了Mantel測試(計算了5000個置換)。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴增的多態(tài)性

從120個引物中篩選出至少能擴增出2條及以上多態(tài)性帶的12個RAPD引物對桃兒七7個種群的140植株個體的DNA樣品進(jìn)行了PCR擴增。不同引物擴增的多態(tài)位點數(shù)不等，形成了帶型豐富、片斷大小及其組合不同的電泳圖譜(圖2)。

擴增片段長度約為200—1500bp，平均每個引物可擴增出9.3條帶，其中多態(tài)性帶平均為2.7條(表2)，引物Psh17擴增的條帶數(shù)最多(12條)且多態(tài)性帶數(shù)亦最多(4條)，引物Psh7和Psh11擴增的條帶數(shù)最少(7條)且多態(tài)性帶數(shù)亦最少(2條)。

圖2 引物Psh17擴增牟尼溝(MNG)桃兒七種群的RAPD電泳圖Fig.2 RAPD profiles of MNG population of S. hexandrum with the primer Psh17

2.2 遺傳多樣性分析

用POPGENE1.31軟件對桃兒七7個種群的遺傳多樣性進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果如表3所示。打西壩(DXB)、杉耳九溝(SEJG)、木斯溝(MSG)、兩河口(LHK)、牟尼溝(MNG)、榆林宮(YLG)、鴨嘴牧場(YZMC)7個種群的多態(tài)性位點百分率(PPB)分別為11.71%、9.01%、4.50%、9.91%、16.22%、9.01%、11.71%。可見，牟尼溝(MNG)種群的多態(tài)位點百分率最高，木斯溝(MSG)種群的多態(tài)位點百分率最低。在種群水平上，7個種群的多態(tài)位點百分率(PPB)平均為10.30%；Nei′s遺傳多樣性(亦稱期望雜合度，He)在0.0065—0.0362之間，平均值為0.0193。Shannon′s信息指數(shù)(亦稱香農(nóng)指數(shù))在0.0110—0.0587之間，平均值為0.0269。各種群的Shannon′s信息指數(shù)大小變化趨勢與多態(tài)位點百分率一致。在物種水平上，其多態(tài)位點百分率、期望雜合度、Shannon指數(shù)分別為28.83%、0.0622、0.0987。RAPD標(biāo)記的遺傳多樣性分析表明桃兒七種群存在較低的遺傳多樣性。

表2 引物及其序列和擴增結(jié)果Table 2 List of primers, their sequences and amplification results

2.3 種群遺傳結(jié)構(gòu)分析

桃兒七種群總的遺傳多樣性(Ht)為0.0622，種群內(nèi)的遺傳多樣性(Hs)為0.0193，表明總的遺傳變異主要來自于種群間。根據(jù)總的遺傳多樣性和種群內(nèi)遺傳多樣性計算不同種群間的分化水平(Gst)所分析的7個桃兒七種群間的Gst為0.6906，即表明總的遺傳變異中有69.06%的變異存在于種群間，種群內(nèi)的遺傳變異為30.94%，說明了種群間的分化水平非常高。種群間的基因流(Nm)為0.2240。

利用分子方差變異分析(AMOVA)對7個桃兒七自然種群的遺傳分化系數(shù)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：總的遺傳變異中有68.74%的變異發(fā)生在種群間，有31.26%的變異發(fā)生在種群內(nèi)，種群間和種群內(nèi)的變異均極顯著(P<0.002)(表4)。比較發(fā)現(xiàn)，AMOVA分析所得結(jié)果與Nei′s遺傳多樣性分化分析所得結(jié)果基本一致，表明桃兒七種群間已出現(xiàn)了非常大程度的遺傳分化。

表3 RAPD標(biāo)記的桃兒七種群遺傳多樣性統(tǒng)計Table 3 Statistical analysis of genetic variation of S. hexandrum populations by RAPD markers

表4 桃兒七種群間和種群內(nèi)分子變異的AMOVA分析結(jié)果Table 4 Analysis of molecular variance (AMOVA) within/among S. hexandrum populations as determined using RAPD markers

2.4 遺傳距離和聚類分析

Nei′s遺傳一致度和遺傳距離的結(jié)果見表5。桃兒七各種群間遺傳一致度(I)值的變化范圍為0.9189—0.9883, 打西壩和榆林宮種群的遺傳一致度最小(一致度值為0.9189)，兩河口和牟尼溝種群遺傳一致度最高(0.9883)；桃兒七各種群間遺傳距離值的變化范圍為0.0118—0.0845,其中DXB和YLG的遺傳距離最大(0.0845)，LHK和MNG的遺傳距離最小(0.0118)。對桃兒七7個種群的Nei遺傳距離與地理距離進(jìn)行了Mantel統(tǒng)計檢驗，結(jié)果表明，種群間的遺傳距離和地理距離之間沒有明顯的相關(guān)性(r=0.3747,P= 0.0350),即遺傳多樣性的分布呈一定的地理趨勢。

表5 桃兒七7個種群間的Nei′s遺傳一致度(對角線上面)和遺傳距離(對角線下面)

Table 5 Nei′s original measures of genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) among 7S.hexandrumpopulations by RAPD markers

種群分布Location打西壩杉耳九溝木斯溝兩河口牟尼溝榆林宮鴨嘴牧場打西壩-0.98150.96910.92030.93340.91890.9264杉耳九溝0.0187-0.98550.93620.94740.93100.9380木斯溝0.03130.0146-0.95040.96230.93130.9380兩河口0.08300.06600.0509-0.98830.94290.9431牟尼溝0.06890.05400.03840.0118-0.94900.9515榆林宮0.08450.07150.07120.05880.0524-0.9823鴨嘴牧場0.07650.06400.06140.05860.04970.0178-

圖3 桃兒七種群間Nei′s遺傳距離的UPGMA聚類圖 Fig.3 UPGMA dendrogram for seven populations of S. hexandrum based on Nei′s genetic distance

聚類結(jié)果(圖3)表明，7個自然種群聚成兩支：YZMC、YLG、MNG 和LHK聚成一支；MSG、SEJG和DXB聚成另外一支。即MNG和LHK種群遺傳距離最小，優(yōu)先聚在一起，然后再與YLG和YZMC聚在一起；MSG和SEJG聚類后，再與DXB種群聚成另外一支。聚成一支的表明它們有較近的親緣關(guān)系。結(jié)合桃兒七種群地理分布，聚類情況為位于北部的打西壩、杉耳九溝及中部木斯溝3個種群聚在一起；位于北部的兩河口和牟尼溝2個種群聚在一支,再和位于南部的榆林宮、鴨嘴牧場2個種群聚在一起。

3 結(jié)論與討論

3.1 桃兒七的遺傳多樣性

通過RAPD標(biāo)記對桃兒七7個自然種群的研究表明：川西地區(qū)桃兒七7個自然種群在物種水平的多態(tài)位點百分率(PPB)為28.83%，稍高于采用AFLP標(biāo)記對相同的這7個種群在物種水平的PPB(25.93%)[7]；但它比分布在我國云南的6個桃兒七種群PPB(DALP分析的PPB = 69.33%6)[8]以及分布在印度Chanb和Kullu地區(qū)的Podophyllum.hexandrum(桃兒七的同種異名) PPB(RAPD標(biāo)記的PPB=100%)都低得多[9]；也比我國已進(jìn)行RAPD標(biāo)記的一些瀕危植物如長葉紅砂(PPB = 89.47%)[12]，崖柏(PPB = 72.09%)[13]，明黨參(PPB = 69%)[14]、水杉(PPB = 52.89%)[15]、版納青梅(PPB = 53.68%)[16]、華木蓮(PPB = 53.22%)[17]的多態(tài)位點百分率都要低得多些； 還稍低(或者說接近)于閩楠(PPB = 36.88%)[18]、銀杉(PPB = 32%)[19]； 僅比極度瀕危植物五針白皮松(PPB = 6.45%)[20]要高。Shannon′s信息指數(shù)表明的結(jié)果是物種水平的值(Ho=0.0987)高于種群水平(Ho=0.0269)。本研究中桃兒七的Nei′s遺傳多樣性(He)為0.0337也是明顯低于前敘的瀕危植物如版納青梅(He= 0.1686)、華木蓮(He= 0.1847)，僅比極度瀕危植物五針白皮松(He= 0.019)要高些。以上數(shù)據(jù)都表明川西地區(qū)桃兒七的遺傳多樣性處于較低的水平。

在所有種群中，牟尼溝(MNG)種群的遺傳多樣性水平最高(PPB為16.22%，He為0.0362)，打西壩(DXB)種群次之(PPB為11.71%，He為0.0224)，木斯溝(MSG)種群的遺傳多樣性水平最低(PPB為4.50%，He為0.0065)。通過實地考察發(fā)現(xiàn)，所有種群的生境都遭受不同程度的破壞，估計是天保工程實施以前，大量砍伐林木所致。遺傳多樣性最高的牟尼溝種群位于自然保護(hù)區(qū)，生境保護(hù)相對完好；而遺傳多樣性相對低的木斯溝種群，當(dāng)?shù)鼐幼∮写迕?，每天有大量?畜)活動，桃兒七生境幾乎全被破壞，桃兒七被大量采挖，殘存的植植株生長細(xì)弱，同其它種群相比，植株提前進(jìn)入衰老狀態(tài)。很多物種的遺傳多樣性研究結(jié)果表明，物種生境的破壞，不僅縮小了物種適宜的生存環(huán)境，而且增加了相近個體的交配機會。桃兒七在自然狀況下是一種自花授粉為主的植物[3]。自花授粉往往就要導(dǎo)致遺傳多樣性的喪失。因此，對桃兒七來說，生境的破壞和以自交為主的繁育方式很可能就是其遺傳多樣性的降低、導(dǎo)致其成為稀有瀕危物種的重要原因。

3.2 桃兒七種群的遺傳結(jié)構(gòu)

應(yīng)用RAPD之類顯性標(biāo)記揭示種群間遺傳分化時，學(xué)者們傾向于將0/1矩陣視為表型數(shù)據(jù)而采用分子變異分析(AMOVA)和Shannon表型多樣性指數(shù)分析。本研究采用Shannon表型多樣性指數(shù)和AMOVA分析方法，分別揭示出桃兒七種群間的變異占69.06%和68.74%，兩者結(jié)果相近。桃兒七種群間已出現(xiàn)了很強的遺傳分化。據(jù)文獻(xiàn)報道,通過同工酶和RAPD分析,遠(yuǎn)交物種的Gst為0.2,近交或自交物種為0.5[24- 25]。本研究表明桃兒七遺傳分化指數(shù)(Gst)值高于通過RAPD研究得出的一些自交物種Gst的平均值，這個結(jié)果與對桃兒七的繁殖生物學(xué)研究結(jié)果是一致的，即桃兒七是一個自交或自交占優(yōu)勢的物種[3]。

基因流在許多稀有植物中較低，有時甚至缺少基因流[26]。在自然狀況下，桃兒七種子傳播距離是很短的。通常桃兒七果實成熟后直接掉下地，經(jīng)過雨水作用，就有一些種子遺留在土中，第二年春夏之際即萌發(fā)成苗；偶爾其種子由牲畜短距離在同種群內(nèi)擴散，極少情形下因鳥類或人為活動在種群內(nèi)或種群間傳播，因此種子短距離傳播是造成由桃兒七有限基因流的原因。在野外實地考察發(fā)現(xiàn)，桃兒七種群分布存在比較明顯的破碎化，生境面積變小造成種群內(nèi)個體數(shù)量減少，因此有限的基因流增大了遺傳漂變效應(yīng)，易造成基因頻率小的等位基因喪失，使得種群間遺傳分化增大,這可能是桃兒七瀕危的主要原因之一。另外，Mantel測試表明遺傳距離和地理距離之間沒有明顯的相關(guān)性。從聚類分析的結(jié)果，雖然分布于松潘縣境內(nèi)地理距離較近的兩河口和牟尼溝種群其遺傳一致度最高，遺傳距離就較??；而地理距離較遠(yuǎn)的分布于北部的打西壩和分布于中南部榆林宮種群間遺傳一致度最小，遺傳距離最大；地理距離最遠(yuǎn)的兩個種群(即最靠北的兩河口種群和地理位置最靠南的鴨嘴牧場種群)間遺傳距離并不是最大的，也就是說總體上并不是地理距離越遠(yuǎn)，遺傳距離越大，地理距離越近，遺傳距離越小。。我們分析產(chǎn)生這種現(xiàn)象的主要原因在于，桃兒七分布范圍較廣，可能由于種群分布的經(jīng)度(介于101°E—104°E)、緯度(28°N—33°N)變化，由此造成不同種群所處位置的溫度、水分、光照、土壤等生態(tài)因子發(fā)生一定程度的變化，環(huán)境變異性強，不同種群所承受的生境選擇壓力存在較大差異，最終導(dǎo)致種群間的遺傳距離與地理距離可能存在較低水平上的關(guān)聯(lián)性。種群間有限的基因流與種群的空間地理隔離的關(guān)系尚需進(jìn)一步深入研究。

3.3 桃兒七遺傳多樣性的保護(hù)策略

了解物種的遺傳結(jié)構(gòu)是進(jìn)行物種保護(hù)最重要的一環(huán)，對于制定科學(xué)的保護(hù)和物種恢復(fù)策略起著極為重要的作用。通過以上RAPD標(biāo)記分析，我們了解了川西地區(qū)桃兒七種群的遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)狀況，對四川西部地區(qū)瀕危植物桃兒七提出以下保護(hù)策略：

(1)實施原位保護(hù)策略

基于RAPD標(biāo)記的桃兒七遺傳多樣性低這一現(xiàn)狀，可對其實施原位保護(hù)策略。在就地保護(hù)時除了對所有種群進(jìn)行必要的保護(hù)外，應(yīng)選擇遺傳多樣性水平高的種群進(jìn)行重點保護(hù)，如本研究中的松潘縣牟尼溝(MNG)種群，其次為紅原縣打西壩(DXB)種群。

(2)實施遷地保護(hù)策略

基于RAPD標(biāo)記的桃兒七遺傳多樣性主要保持在種群之間，種群間變異量接近70%，因此在桃兒七遷地保護(hù)時應(yīng)盡量在較多的種群中取樣，盡量保護(hù)所有現(xiàn)有種群。

(3)保護(hù)和重建桃兒七種群的適宜生境

桃兒七對生長環(huán)境要求特殊，建議有關(guān)部門對桃兒七較為集中的生長地采取封山或禁牧，禁止濫采亂挖等措施。只有保護(hù)好它的生境，才能保證它正常生長、繁育,從而保護(hù)其遺傳多樣性。

[1] 應(yīng)俊生. 小檗科八角蓮屬和桃兒七屬(新屬)的研究. 植物分類學(xué)報, 1979, 17(1): 15- 23.

[2] 楊顯志, 邵華, 張玲琪, 周成, 宣群, 楊春燕. 鬼臼毒素資源研究現(xiàn)狀. 中草藥, 2001, 32(11): 1042- 1044.

[3] 馬紹賓, 胡志浩. 桃兒七分布格局與生態(tài)適應(yīng)的初步研究. 武漢植物學(xué)研究, 1996, 14(1): 47- 54.

[4] 傅立國. 中國植物紅皮書——稀有瀕危植物, 第一冊. 北京: 科學(xué)出版社, 1992: 184- 184.

[5] 馬紹賓, 胡志浩. 小檗科鬼臼亞科植物核型研究. 云南植物研究, 1996, 18(3): 325- 330.

[6] Kosenko V N. Comparative karyological study of representatives of the family Berberidaceae. Botanicheskii Zhurnal, 1979, 64(11): 1539- 1552.

[7] Xiao M, Li Q, Guo L, Luo T, Duan W X, He W X, Wang L, Chen F. AFLP analysis of genetic diversity of the endangered speciesSinopodophyllumhexandrumin the tibetan region of Sichuan province, China. Biochemical Genetics, 2006, 44(1): 47- 60.

[8] 吳剛, 虞泓, 崔光芬. 云南桃兒七遺傳多樣性的DALP分析. 中草藥, 2009, 40(6): 951- 955.

[9] Sharma K D, Singh B M, Sharma T R, Katoch M, Guleria S. Molecular analysis of variability inPodophyllumhexandrumRoyle an endangered medicinal herb of northwestern Himalaya. Plant Genetic Resources Newsletter, 2000, 124: 57- 61.

[10] Williams J G K, Kubelik A R, Livak K J, Rafalski J A, Tingey S V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, 1990, 18(22): 6531- 6535.

[11] 鄒喻萍, 葛頌, 王曉東. 系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)中的分子標(biāo)記. 北京: 科學(xué)出版社, 2001.

[12] 張穎娟, 王玉山. 瀕危小灌木長葉紅砂種群的遺傳多樣性. 林業(yè)科學(xué), 2008, 44(12): 43- 47.

[13] 張仁波, 竇全麗, 何平, 鄧洪平. 瀕危植物崖柏遺傳多樣性研究. 廣西植物, 2007, 27(5): 687- 691.

[14] 邱英雄, 傅承新. 明黨參的瀕危機制及其保護(hù)對策的初步研究. 生物多樣性, 2001, 9(2): 151- 156.

[15] 李春香, 楊群, 周建平, 范深厚, 楊洪. 水杉自然居群遺傳多樣性的RAPD研究. 中山大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 1999, 38(1): 59- 63.

[16] 李巧明, 許再富, 何田華. 瀕危植物版納青梅保護(hù)遺傳學(xué)研究初報. 植物學(xué)報, 2002, 44(2): 246- 249.

[17] 林新春, 俞志雄, 裘利洪, 肖國民, 劉力. 瀕危植物華木蓮的遺傳多樣性研究. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2003, 25(6): 805- 810.

[18] 江香梅, 溫強, 葉金山, 肖復(fù)明, 江梅. 閩楠天然種群遺傳多樣性的RAPD分析. 生態(tài)學(xué)報, 2009, 29(1): 438- 444.

[19] 汪小全, 鄒喻蘋, 張大明, 洪德元, 劉正宇. 銀杉遺傳多樣性的RAPD研究. 中國科學(xué)(C輯), 1996, 26(5): 436- 441.

[20] 張志勇, 李德銖. 極度瀕危植物五針白皮松的保護(hù)遺傳學(xué)研究. 云南植物研究, 2003, 25(5): 544- 550.

[21] Yeh F C, Yang R C, Boyle T B J, Ye Z H, Mao J X. POPGENE, the user-friendly shareware for population genetic analysis. Molecular Biology and Biotechnology Center, Canada: University of Alberta, 1997.

[22] Excoffer L, Smouse P E, Quattro J M. Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics, 1992, 131: 479- 491.

[23] Miller M P. Tools for Population Genetic Analysis (TEPGA), Version 1. 3. Department of Biological Sciences, Northern Arizona University, Arizona, USA, 1997.

[24] Hamrick J L, Godt M J W. Allozyme diversity in plant species//Brown A H D, Clegg M T, Kahler A L, Weir B S. Plant Population Genetics, Breeding and Genetic Resources. Sunderland, Massachusetts: Sinauer, 1989: 43- 63.

[25] Nybom H, Bartish I V. Effects of life history traits and sampling strategies on genetic diversity estimates obtained with RAPD markers in plants. Perspectives in Plant Ecology, Evolution and Systematics, 2000, 3(2): 93- 114.

[26] Slatkin M. Gene flow in natural populations. Annual Reviews Ecology Systematics, 1985, 16: 393- 430.

RAPD analysis of genetic diversity of an endangered speciesSinopodophyllumhexandrum(Royle) Ying from Western Sichuan Province, China

XIAO Meng1,2, LI Qun1,3, GUO Liang1, TANG Lin1, WANG Li1, CHEN Fang1,*

1CollegeofLifeSciences,SichuanUniversity,Chengdu610064,China2SichuanTourismUniversity,Chengdu610100,China3CollegeofLifeSciences,SichuanNormalUniversity,Chengdu610066,China

Sinopodophyllumhexandrum(Royle) Ying is an important medicinal and endangered species. Recently, the size of the wild population ofS.hexandrumin western Sichuan Province has been noted to be very low and declining rapidly. Analysis of random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers was conducted on seven natural populations ofS.hexandrumin western Sichuan Province in order to investigate the genetic diversity and genetic structure of the populations. Leaf samples of 140 individuals from the seven populations were collected. Twelve RAPD primers were designed to generate highly reproducible and stable DNA fragments (the sizes of DNA bands ranged from 200 to 1500 bps). One hundred and eleven discernible DNA fragments were produced depending on these primers, and 32 fragments were polymorphic loci (mean 9.3 bands and 2 .7 polymorphic bands per primer). The percentage of polymorphic bands (PPB) was 28.83% at the species level, and PPB within population ranged from 4.50% to 16.22% with an average of 10.30%. The result of POPGENE analysis indicated that the level of genetic variation ofS.hexandrum(He=0.0622，Ho=0.0987) was lower than other endangered plants. At the species level, the average effective number of alleles per locus (Ae) was 1.1011. The average expected heterozygosity was estimated to be 0.0193 within populations (He) and 0.0622 at the species level (Ht). Shannon′s index (Ho) ranged from 0.0110 to 0.0587, with an average of 0.0269 at the population level (Hpop) and 0.0987 at the species level (Hsp). Among the seven populations investigated further, the MNG population revealed higher variability (PPB, 16.22%;Ae, 1.0569;He, 0.0362;Ho, 0.0587), whereas the MSG population had the lowest variability (PPB, 4.50%;Ae, 1.0105;He, 0.0065;Ho, 0.0110). As revealed by the AMOVA analysis, a high level of genetic differentiation among populations was detected, 68.74% of the genetic differentiation occurred between populations and 31.26% within populations. Gene flow (Nm=0.4429) was low between natural populations ofS.hexandrumin the area. Nei′s genetic identity (I) values varied from 0.9189 to 0.9883 between the pairs of populations; Populations DXB and YLG had the lowest (0.9189), whereas MNG and LHK had the highest (0.9883) .The dendrogram was constructed by the UPGMA method using Nei′s genetic distance values based on RAPD. Two clusters were defined among seven populations，no significant correlation was found between geographic distribution and the genetic distance on the UPGMA tree. The correlation coefficient (r= 0.3747;P= 0.0350) by Mantel test did not show any significant relationship between the matrices of geographical distances and pair-wise genetic distances based on RAPD. Species breeding system and limited gene flow among populations were plausible reasons for the high genetic differentiation observed in this species. On the basis of the genetic and ecological information, some appropriate strategies for conserving the endangered medicinal species in this region were proposed: namely, keeping a stable environment suitable for the breeding and growth of population, rescuing and conserving the core populations (such as MNG in Songpan County) for in situ conservation and also trying to protect all of the existing populations.

Sinopodophyllumhexandrum; RAPD; genetic diversity; genetic structure; conservation strategy

國家科技部重點項目(中國西南關(guān)鍵動植物保護(hù)工程)

2013- 09- 27;

日期:2014- 07- 14

10.5846/stxb201309272376

*通訊作者Corresponding author.E-mail: chenfang@scu.edu.cn

肖猛, 李群, 郭亮, 唐琳, 王麗, 陳放.四川西部瀕危植物桃兒七遺傳多樣性的RAPD分析.生態(tài)學(xué)報,2015,35(5):1488- 1495.

Xiao M, Li Q, Guo L, Tang L, Wang L, Chen F.RAPD analysis of genetic diversity of an endangered speciesSinopodophyllumhexandrum(Royle) Ying from Western Sichuan Province, China.Acta Ecologica Sinica,2015,35(5):1488- 1495.