苦參堿對(duì)炎癥狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞B7-H1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

吳瑗(廣東醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室，廣東湛江524023)

苦參堿對(duì)炎癥狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞B7-H1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

吳瑗(廣東醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室，廣東湛江524023)

摘要：目的探討苦參堿對(duì)炎癥狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞B7-H1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響。方法取人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)用于實(shí)驗(yàn)。 ①苦參堿濃度對(duì)B7-H1的影響：設(shè)對(duì)照組、模型組及苦參堿低、中、高劑量組，對(duì)照組僅加含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，模型組及苦參堿低、中、高濃度組加入終濃度為100 g/L的IFN-γ，苦參素低、中、高濃度組再分別加入0.5、0.8、1.0 g/L的苦參堿；培養(yǎng)24 h，采用RT-PCR法檢測(cè)HK-2細(xì)胞中的B7-H1 mRNA，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B7-H1蛋白。②苦參堿干預(yù)時(shí)間對(duì)B7-H1的影響：設(shè)對(duì)照組、模型組及苦參堿不同培養(yǎng)時(shí)間組(12、16、24 h)，對(duì)照組僅加含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，模型組加終濃度為100 g/L的IFN-γ培養(yǎng)24 h，苦參堿12 h、16 h、24 h組加入終濃度為100 g/L的IFN-γ和0.8 g/L的苦參堿，分別培養(yǎng)12、16、24 h，采用RT-PCR法檢測(cè)HK-2細(xì)胞中的B7-H1 mRNA。結(jié)果 模型組B7-H1 mRNA及其蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組，苦參堿低、中、高濃度組低于模型組(P均﹤0.05)；苦參堿12 h、16 h、24 h組B7-H1 mRNA及其蛋白表達(dá)低于模型組(P均﹤0.05)?？鄥A抑制HK-2細(xì)胞B7-H1 mRNA表達(dá)作用呈劑量、時(shí)間依賴性，對(duì)B7-H1蛋白的抑制作用也呈劑量依賴性(P均﹤0.05)。結(jié)論 IFN-γ誘導(dǎo)的炎癥狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞B7-H1 mRNA、蛋白表達(dá)增高，苦參堿可下調(diào)B7-H1 mRNA、蛋白表達(dá)。

關(guān)鍵詞：苦參堿；腎小管上皮細(xì)胞；B7-H1基因;協(xié)同刺激分子

苦參堿是一種從傳統(tǒng)中草藥苦參中提取出來(lái)的苦參型生物堿。研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿不僅具有抗炎、抗腫瘤、抗心律失常、抗肝臟纖維化及免疫調(diào)節(jié)作用[1～3]，對(duì)腎臟亦有一定的保護(hù)作用[4，5]，但確切機(jī)制未明。腎小管上皮細(xì)胞(TEC)和T淋巴細(xì)胞參與的細(xì)胞免疫是腎小管間質(zhì)病變的重要環(huán)節(jié)。T細(xì)胞活化不僅需要第一信號(hào)(抗原肽-MHCⅠ/Ⅱ復(fù)合物)，亦需要第二信號(hào)(協(xié)同刺激信號(hào))。有文獻(xiàn)報(bào)道，TEC作為抗原提呈細(xì)胞，可表達(dá)協(xié)同刺激分子(如CD40、B7RP-1等)，提供T細(xì)胞活化的第二信號(hào)[6]。B7-H1是最近發(fā)現(xiàn)的協(xié)同刺激分子，其配體為PD-1。目前研究證實(shí)PD-1/B7-H1通路在多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[7，8]。2012年12月～2013年12月，我們觀察了苦參堿對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)的炎癥狀態(tài)下TEC中B7-H1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響，探討苦參堿腎臟保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)由廣東醫(yī)學(xué)院腎臟病研究所惠贈(zèng)。DMEM培養(yǎng)液及胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司?？鄥A購(gòu)自西安中鑫生物科技公司。Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司。SYBR Premix Ex TaqⅡ購(gòu)自大連TaKaRa生物工程公司。B7-H1及內(nèi)參照β-actin的引物由上海生工生物工程公司合成。人IFN-γ購(gòu)自PeproTech公司，PE標(biāo)記小鼠抗人B7-H1單克隆抗體購(gòu)自eBioscience公司。倒置相差顯微鏡(Nikon)，實(shí)時(shí)定量PCT儀(ABI 7300)，Galios流式細(xì)胞儀(Beckman)。

1.2細(xì)胞分組與處理①不同苦參堿濃度分組：對(duì)照組僅加含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，模型組及苦參堿低、中、高濃度組均加入終濃度為100 g/L的IFN-γ，苦參素低、中、高濃度組再分別加入0.5、0.8、1.0 g/L的苦參堿，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后檢測(cè)B7-H1 mRNA及蛋白。②不同苦參堿干預(yù)時(shí)間分組：對(duì)照組僅加含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，模型組加入終濃度為100 g/L的IFN-γ培養(yǎng)24 h，苦參堿12 h、16 h、24 h組均加入終濃度為100 g/L的IFN-γ和0.8 g/L的苦參堿，分別培養(yǎng)12、16、24 h。

1.3 HK-2細(xì)胞中B7-H1 mRNA及其蛋白檢測(cè) ①B7-H1 mRNA：采用RT-PCR法。加入Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，取2 μg細(xì)胞總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。B7-H1上游引物為5′-CTGCATGATCAGCTA-TGGTGGTG-3′，下游引物為5′-CAGTTCATGTTCAGA-GGTGACTGGA-3′；內(nèi)參基因β-actin上游引物為5′-CCATGTACGTTGCTATCCAGG-3′，下游引物為5′-TCTCCTTAATGTCACGCACGA-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。計(jì)算B7-H1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。②B7-H1蛋白：采用直接免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。0.1%胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL；轉(zhuǎn)入流式管，1×PBS洗2次，棄上清，每管加入100 μL PBS，制成細(xì)胞懸液1×106/100 μL，每100 μL細(xì)胞懸液中加入小鼠抗人B7-H1單克隆抗體7 μL；冰上避光作用30 min，PBS洗2次細(xì)胞，1 500 r/min、4 ℃離心5 min，收集細(xì)胞，加入500 μL PBS進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。設(shè)小鼠IgG1抗體代替小鼠抗人B7-H1單克隆抗體的同型對(duì)照。用Cellquest軟件分析HK-2細(xì)胞表達(dá)B7-H1的平均熒光強(qiáng)度(MFI)，代表B7-H1蛋白表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1不同濃度苦參堿處理后HK-2細(xì)胞B7-H1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量模型組HK-2細(xì)胞B7-H1 mRNA及蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，苦參堿低、中、高濃度組均低于模型組(P均﹤0.05)；苦參堿呈劑量依賴性抑制HK-2細(xì)胞B7-H1 mRNA、蛋白表達(dá)(P均﹤0.05)。見(jiàn)表1。

表1　不同濃度苦參堿處理后HK-2細(xì)胞B7-H1 mRNA及

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組比，#P<0.05。

2.2苦參堿處理后不同時(shí)間HK-2細(xì)胞B7-H1 mRNA相對(duì)表達(dá)量對(duì)照組、模型組及苦參堿12 h、16 h、24 h組HK-2細(xì)胞B7-H1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.13、2.95±0.07、1.87±0.86、1.32±0.06、0.98±0.03，其中模型組高于對(duì)照組，苦參堿12 h、16 h、24 h組低于模型組(P均﹤0.05)?？鄥A呈時(shí)間依賴性抑制HK-2細(xì)胞B7-H1 mRNA表達(dá)(P均﹤0.05)。

3討論

大量文獻(xiàn)報(bào)道，在免疫性腎損傷過(guò)程中，TEC不僅是受害者，也是炎癥損傷的參與者。TEC可能作為一種非專職的抗原提呈細(xì)胞提呈抗原，激活T細(xì)胞。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，TEC不表達(dá)經(jīng)典的共刺激分子B7，因此認(rèn)為在TEC與T細(xì)胞相互作用中，可能有另外的共刺激信號(hào)分子參與。B7-H1為共刺激分子B7家族的新成員，主要表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞，與表達(dá)在T細(xì)胞的配體PD-1結(jié)合，調(diào)控T細(xì)胞增殖與分化，在機(jī)體免疫耐受中發(fā)揮重要作用[9]。而對(duì)于B7-H1具體的生物學(xué)功能，學(xué)者們研究結(jié)論不同。文獻(xiàn)[8，9]報(bào)道B7-H1可抑制T細(xì)胞活化，起負(fù)性調(diào)控作用；而Dong等[10]則報(bào)道B7-H1與單克隆抗體結(jié)合后可導(dǎo)致類風(fēng)濕性疾病患者T細(xì)胞異?；罨Ｒ延醒芯勘砻?，對(duì)B7-H1/PD-1通路進(jìn)行干預(yù)有助于狼瘡性腎炎等自身免疫性疾病的治療[10，11]。本研究結(jié)果顯示，正常狀態(tài)下TEC表達(dá)少量B7-H1 mRNA及蛋白，而在炎癥狀態(tài)下(IFN-γ誘導(dǎo))B7-H1表達(dá)顯著上調(diào)，這與De Haij等[12]的研究結(jié)果一致。推測(cè)TEC表達(dá)的B7-H1可能與其周圍T細(xì)胞上的受體PD-1結(jié)合，調(diào)控T細(xì)胞活化，引起腎小管間質(zhì)病變。

近年研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿可抑制多種炎性因子如IL-23、IL-17、TNF-α及黏附分子ICAM-1、VCAM-1等分泌，在防治自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[2，13]。目前苦參堿被應(yīng)用于肝硬化、心律失常及腫瘤等多種疾病的治療，但其在腎臟疾病中的治療作用機(jī)制尚未明確。本研究結(jié)果顯示，苦參堿在一定劑量范圍內(nèi)，可下調(diào)HK-2細(xì)胞中B7-H1 mRNA、蛋白表達(dá)水平，具有一定劑量依賴性，其抑制B7-H1 mRNA表達(dá)的作用也呈時(shí)間依賴性，提示苦參堿在基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平均可抑制炎癥狀態(tài)下TEC中B7-H1表達(dá)，有望在腎臟疾病的防治中發(fā)揮一定作用。至于苦參堿是否通過(guò)下調(diào)TEC中B7-H1表達(dá)從而抑制T細(xì)胞活化，達(dá)到緩解腎病進(jìn)展的作用，尚需進(jìn)一步研究。

另有文獻(xiàn)報(bào)道，苦參堿可使腎小球系膜增生、硬化程度明顯減輕；可抑制NF-κB活化，下調(diào)IL-6、TNF-α及MCP-1表達(dá)，延緩腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化；還能部分恢復(fù)腎小管間質(zhì)中基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-1(TIMP-1)、纖維連接蛋白(FN)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的表達(dá)，從而延緩腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)程[4，5,14]。

分析上述研究結(jié)果，苦參堿可能通過(guò)多個(gè)環(huán)節(jié)抑制腎臟的炎性病變，在防治腎臟疾病中發(fā)揮一定作用。

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Effect of matrine on the expression of B7-H1 in tubular epithelial cells

WUYuan

(DepartmentofMicrobiologyandImmunology,GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524023,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the effect of matrine on expression of B7-H1 in tubular epithelial cells. Methods ①The effect on different dose of matrine: human HK-2 cells were cultured under five culture conditions to observe and divided into 4 groups, which was control group(5% fetal calf serum+DMEM for 24 h), model group (IFN-100 g/L for 24 h), matrine group (IFN-100 g/L+0.8 g/L matrine for 12 h,16 h and 24 h) . The expression of B7-H1 mRNA was evaluated by using real time RT-PCR. The surface expression of B7-H1 on HK-2 was analyzed by using flow cytometry. ②The effect on different time of matrine: cell were divided into control group(5% fetal calf serum+DMEM for 24 h), model group (IFN-100 g/L for 24 h), matrine group (IFN- 100 g/L+0.8 g/L matrine for 12 h,16 h and 24 h). The expression of B7-H1 mRNA was evaluated by using real time RT-PCR. ResultsThe expression of B7-H1 on HK-2 cells was decreased in normal condition. IFN- can significantly increased the expression of B7-H1. Matrine decreased the B7-H1 expression of HK-2 cells in a dose and time dependent way at mRNA levels and in a dose dependent way at protein levels (P<0.05). ConclusionB7-H1 mRNA and protein increased under the condition of inflammation induced by IFN-γ. Matrine could down regulate the expression of B7-H1 mRNA and protein.

Key words:matirne；tubular epithelial cell; B7-H1; co-stimulatory molecule

(收稿日期：2014-12-01)

作者簡(jiǎn)介：第一吳瑗(1975-)，女，醫(yī)學(xué)碩士，副教授，主要從事免疫性腎疾病的研究。E-mail:717748644@qq.com

基金項(xiàng)目：廣東省中醫(yī)藥管理局科研基金資助項(xiàng)目(ZY0904)；廣東醫(yī)學(xué)院科研基金面上項(xiàng)目(XK0801)。

中圖分類號(hào)：R692

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2015)02-0005-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.02.002