胃癌細(xì)胞herg mRNA、HERG蛋白表達(dá)及HERG電流強(qiáng)度變化

邵曉冬，張永國(guó)，陳江，王金玲，郭曉鐘，任麗楠(沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院，沈陽(yáng)110016)

·論著·

胃癌細(xì)胞herg mRNA、HERG蛋白表達(dá)及HERG電流強(qiáng)度變化

邵曉冬，張永國(guó)，陳江，王金玲，郭曉鐘，任麗楠(沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院，沈陽(yáng)110016)

摘要：目的探討胃癌細(xì)胞herg mRNA、HERG蛋白表達(dá)及HERG電流強(qiáng)度的變化的臨床意義。方法培養(yǎng)胃癌細(xì)胞(胃癌細(xì)胞系SGC7901、MGC803、AGS、MKN45)及永生化胃上皮細(xì)胞(GES)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。采用RT-PCR法檢測(cè)herg mRNA表達(dá)，Western blot法檢測(cè)HERG蛋白表達(dá)，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)測(cè)定SGC7901及GES的HERG電流強(qiáng)度。結(jié)果herg mRNA及其蛋白在4種胃癌細(xì)胞系中均有表達(dá)，AGS中HERG蛋白表達(dá)量低于其他三種細(xì)胞系(P均<0.05)；GES中無(wú)herg mRNA及其蛋白表達(dá)。在SGC7901中檢測(cè)到HERG電流， GES中未記錄到HERG電流。結(jié)論herg mRNA及其蛋白在胃癌細(xì)胞系SGC7901、MGC803、AGS、MKN45表達(dá)增高，SGC7901中存在HERG電流。HERG蛋白可能參與了胃癌的發(fā)生，并與胃癌惡性程度有關(guān)。

關(guān)鍵詞：胃腫瘤，胃癌；herg基因；HERG蛋白；HERG電流；延遲整流鉀通道；腫瘤形成過(guò)程

胃癌的發(fā)病機(jī)制目前尚未清楚，化療和生物治療效果不理想。近年來(lái)，關(guān)于鉀離子通道與腫瘤發(fā)病關(guān)系的研究較多[1～3]，其中電壓門(mén)控性鉀通道與惡性腫瘤的關(guān)系已成為腫瘤研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。HERG蛋白構(gòu)成延遲整流性鉀通道的α亞單位，已有研究表明，多種不同組織起源的惡性腫瘤細(xì)胞中均可檢測(cè)到HERG蛋白及其功能性電流，而正常組織細(xì)胞則無(wú)HERG蛋白表達(dá)[4]。2005年1月～2010年12月，我們對(duì)胃癌細(xì)胞中herg mRNA及其蛋白進(jìn)行檢測(cè)，并觀察細(xì)胞中HERG電流強(qiáng)度的變化，探討HERG蛋白與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)永生化胃上皮細(xì)胞(GES)引自北京腫瘤研究所。胃癌細(xì)胞系SGC7901、MGC803、AGS、MKN45引自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。細(xì)胞接種于含10% FBS、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2、95%空氣中常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2檢測(cè)項(xiàng)目

1.2.1herg mRNA采用RT-PCR法。引物由上海生工生物工程公司合成。herg上游序列為5′-TCCAGCGGCTGTACTCGGGC-3′，下游序列為5′-TGGACCAGAAGTGGTCGGAGAACTC -3′；以β-actin為內(nèi)參，上游序列為 5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游序列為5′-CTCCTTAAGTCACGCACGATTTC-3′。Trizol提取細(xì)胞總RNA，驗(yàn)證所提取RNA的質(zhì)量，紫外分光光度儀測(cè)RNA濃度。反應(yīng)體系共20 μL：總RNA 1～2 μg，oligo(dT)18 1 μL，無(wú)RNA酶的去離子水12 μL，5×反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4 μL，10 mM dNTPS 2 μL，RNA酶抑制劑1 μL，M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶 1 μL，獲得cDNA產(chǎn)物。PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1 μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液(含鎂) 5 μL，Taq 酶0.5 μL，10 mM上游引物1 μL，10 mM下游引物1 μL，dNTPs 1 μL，去離子水40.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 90 s，65 ℃ 180 s，72 ℃ 90 s，共進(jìn)行43個(gè)循環(huán)， 72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。

1.2.2HERG蛋白采用Western blot法。制備細(xì)胞總蛋白，分裝后儲(chǔ)于-70 ℃?zhèn)溆?；以牛血清白蛋白作為?biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定樣品蛋白質(zhì)濃度。將樣品轉(zhuǎn)移到經(jīng)緩沖液浸泡的SDS-PAGE凝膠(0.8 mA/cm2，時(shí)間90 min)；用麗春紅染液對(duì)濾膜進(jìn)行染色，標(biāo)記蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)條帶，去離子水洗去染料；濾膜經(jīng)8%脫脂奶粉于室溫封閉2 h，與4%脫脂奶粉稀釋的抗體(抗HERG 1∶1 000，抗β-actin 1∶5 000)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST搖洗4次×15 min；與4%脫脂奶粉稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG室溫孵育4 h，TBST搖洗4次×15 min；等量混合ECL顯色系統(tǒng)中A+B液，滴加至硝酸纖維素膜；X線(xiàn)膠片感光。以β-actin作為內(nèi)參，采用Quantity-one軟件計(jì)算各樣品HERG蛋白表達(dá)水平，進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。

1.2.3HERG電流檢測(cè)前2 h將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC7901及GES細(xì)胞消化，接種到剪裁好的載玻片備用。采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)測(cè)定，pClamp8.0軟件控制反應(yīng)參數(shù)，通過(guò)A/D和D/A轉(zhuǎn)換器與放大器連接。步驟：將電極液灌充到硼硅酸鹽玻璃管，使其電極尖端阻抗為3～5 MΩ，由電極尾部灌充經(jīng)0.2 μm濾膜過(guò)濾的電極內(nèi)液；在微推進(jìn)器幫助下，向膜片電極施加正壓同時(shí)使電極尖端接近細(xì)胞表面；將電位固定在0 mV，連續(xù)給予強(qiáng)度為1 mV、間期為10～20 ms的去極化脈沖波，監(jiān)測(cè)電流變化；電極尖端到達(dá)細(xì)胞表面時(shí)，減小應(yīng)答脈沖波電流，將電極內(nèi)壓從正壓轉(zhuǎn)變?yōu)槿踟?fù)壓，使電流進(jìn)一步減小，即在電極尖端和細(xì)胞膜之間形成高阻抗(3～20 GΩ)封接；在細(xì)胞吸附狀態(tài)下，施加負(fù)壓吸引破膜或予電擊破膜；鉗制電位0 mV，將膜電位從-120 mV階梯式改變到20 mV，階躍升幅為20 mV，刺激持續(xù)1 s，間歇1 s，刺激頻率為0.2 Hz；記錄跨膜電流，觀察電流變化。通過(guò)檢測(cè)在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入HERG蛋白特異阻斷劑cisapride后的電流變化，確定細(xì)胞中是否存在HERG電流。

2結(jié)果

2.1herg mRNA表達(dá)RT-PCR結(jié)果顯示，在所檢測(cè)的四種人胃癌細(xì)胞系MGC803、AGS、MKN45和SGC7901中均有herg mRNA表達(dá)，而GES中無(wú)herg mRNA表達(dá)(見(jiàn)圖1)。

圖1　不同細(xì)胞中herg mRNA表達(dá)

2.2HERG蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，GES中無(wú)HERG蛋白表達(dá)，AGS、SGC7901、MKN45、MGC803中HERG蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為646.33±54.39、1 369.33±40.29、1 335.67±63.62、1 087.33±24.36，AGS中HERG蛋白相對(duì)表達(dá)量低于其他三種胃癌細(xì)胞系(P均<0.05)。

2.3HERG電流SGC7901檢測(cè)到HERG電流，GES中則未檢測(cè)到HERG電流。

3討論

herg基因定位于7號(hào)染色體長(zhǎng)臂，含16個(gè)外顯子，編碼含1 159個(gè)氨基酸的多肽，分子量約127 kD。herg基因的表達(dá)產(chǎn)物為HERG蛋白，組成延遲整流性鉀通道的α亞基，該通道電流具有以下特點(diǎn)：①依賴(lài)去極化的活化門(mén)控開(kāi)放，快速、超極化依賴(lài)的通道失活，導(dǎo)致電導(dǎo)降低，產(chǎn)生內(nèi)向整流；②對(duì)Ⅲ型抗心律失常藥物敏感；③最大電導(dǎo)的細(xì)胞外鉀濃度依賴(lài)性[5～7]。研究表明，小鼠胎心細(xì)胞中HERG電流占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而在成熟心肌細(xì)胞則喪失了優(yōu)勢(shì)地位，但當(dāng)成熟心肌細(xì)胞去分化或癌變時(shí)，HERG電流則重新占優(yōu)勢(shì)。同樣，在小鼠神經(jīng)嵴神經(jīng)元的發(fā)育過(guò)程中，HERG電流僅在神經(jīng)元發(fā)育極早階段有瞬時(shí)表達(dá)，而后即被內(nèi)向整流性鉀電流所取代[8]。HERG電流的上述變化趨勢(shì)與臨床常用的胚胎基因相關(guān)腫瘤標(biāo)志物如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)的表達(dá)變化具有相似性。有研究發(fā)現(xiàn)HERG蛋白表達(dá)于多種惡性腫瘤細(xì)胞[4]，該分子可能對(duì)惡性腫瘤的早期診斷具有一定價(jià)值。

我們前期研究在三種人白血病細(xì)胞中檢測(cè)到HERG電流，且電流強(qiáng)度與蛋白豐度相關(guān)，證實(shí)HERG電流在白血病細(xì)胞系增殖中發(fā)揮一定作用。本研究觀察了胃癌細(xì)胞與GES中herg基因、蛋白表達(dá)及HERG電流的變化，結(jié)果顯示，herg基因及其蛋白在四種胃癌細(xì)胞系中均有表達(dá)，在GES中不表達(dá)，表明herg基因及其蛋白可能與胃癌發(fā)病有關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)，4種胃癌細(xì)胞系中，以致瘤性較低的AGS中HERG蛋白表達(dá)量最低，而在分化程度較低的MKN45、MGC803及源于胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的SGC7901中表達(dá)較強(qiáng)，同時(shí)在SGC7901中檢測(cè)到了HERG電流，提示HERG蛋白可能與胃癌惡性程度及侵襲性有關(guān)，這將在后續(xù)研究中加以證實(shí)。

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Expression of herg gene, protein and changes of HERG current in gastric cancer cells

SHAOXiao-dong,ZHANGYong-guo,CHENJiang,WANGJin-ling,GUOXiao-zhong，RENLi-nan

(GeneralHospitalofShenyangMilitaryCommandArea,Shenyang110016,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of herg gene, HERG protein and HERG current in gastric cancer cells. MethodsGastric cancer cells and gastric epithelial (GES) cells were cultured to logarithmic phase. The expressions of herg mRNA and HERG protein in gastric cancer cells and GES cells were measured by using RT-PCR and Western blot, respectively. The whole cell configuration of the patch-clamp technique was employed to record HERG currents in various cells. ResultsHERG mRNA and protein were positively expressed in four gastric cancer cell lines. Expression level of HERG protein in AGS cells was lower compared with the other three gastric cancer cell lines (P<0.05). There was negative expression of herg mRNA and HERG protein in GES cell line. HERG current was detected in gastric cancer cell, whereas there was no HERG current in GES cell. ConclusionHerg gene and HERG protein were highly expressed in gastric cancer cells and HERG current was exclusively detected in gastric cancer cells. HERG protein was associated with carcinogenesis of gastric cancer and may serve as a diagnostic marker for gastric cancer.

Key words:stomach neoplasms; human ether-a-go-go-related gene; HERG protein; HERG current； delayed rectifier potassium channel; neoplastic processes

(收稿日期：2014-08-09)

通信作者簡(jiǎn)介：任麗楠(1973-)，女，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)槲改c道惡性腫瘤的發(fā)生機(jī)制。E-mail： ren_li_nan@hotmail.com

作者簡(jiǎn)介：第一邵曉冬(1970-)，男，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)槲赴┌l(fā)生機(jī)制。E-mail： sxdsys608@sohu.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30400204)。

中圖分類(lèi)號(hào)：R735.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2015)02-0001-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.02.001