生理活性物質(zhì)復(fù)合制劑對低溫脅迫煙草植株光合活性的影響

羅真華，高志強，張紅兵，謝會雅，周 毅，賀利雄，史端甫（.湖南省煙草公司株洲市分公司，湖南 株洲 4000；.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 408；.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖南 長沙 408）

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生理活性物質(zhì)復(fù)合制劑對低溫脅迫煙草植株光合活性的影響

羅真華1，高志強1，張紅兵1，謝會雅1，周 毅1，賀利雄2，史端甫3
（1.湖南省煙草公司株洲市分公司，湖南 株洲 412000；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖南 長沙 410128）

摘 要：以煙草K326、云87為材料，對生理活性物質(zhì)復(fù)合制劑改善遭遇低溫逆境脅迫煙草植株光合活性的生理效果進行了評價。結(jié)果表明：低溫逆境遭遇期間和常溫生長恢復(fù)期間，復(fù)合制劑處理的植株在低溫逆境響應(yīng)及常溫生長恢復(fù)方面明顯優(yōu)于對照，植株的凈光合速率（Pn）、氣孔傳導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr）和葉綠素?zé)晒鈪?shù)最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、PSII量子產(chǎn)量（ΦPSII）、表觀電子傳導(dǎo)率（ETR）、非光化學(xué)淬滅（NPQ）的變化均優(yōu)于對照；表明該復(fù)合制劑可減輕低溫逆境對煙草植株光合作用的抑制作用，改善植株煙草低溫逆境抗性。

關(guān)鍵詞：煙草；生理活性物質(zhì)；低溫脅迫；光合作用

煙草生產(chǎn)中早春季節(jié)頻繁發(fā)生的低溫危害（即“倒春寒”），將導(dǎo)致煙草移栽后幼苗受害、大田前期生長緩慢以及發(fā)生早花現(xiàn)象，煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重的影響，這已成為煙草生產(chǎn)中的突出問題[1]。目前，對于早春低溫危害主要是通過適宜品種選擇、剪葉煉苗、適時移栽和平衡施肥等栽培措施來應(yīng)對；對于低溫導(dǎo)致的煙草早花，則主要是通過“放棄主莖，培育杈煙”、加強肥培的措施來補救。研究表明，多種植物生理活性物質(zhì)對植物的逆境抗性具有調(diào)節(jié)作用[2-4]；因此，制備生理活性物質(zhì)抗性調(diào)節(jié)劑、通過葉面噴施來改善煙草植株抗性，不失為煙草生產(chǎn)中減輕早春低溫危害的有效農(nóng)藝措施。

光合作用是對溫度最為敏感的生理過程之一，低溫等逆境條件抑制植物光合作用，甚至引起或加劇光抑制現(xiàn)象；植物受低溫逆境脅迫后即使恢復(fù)到適宜生長條件下，較長時期內(nèi)其光合作用仍維持在較低水平，嚴(yán)重影響光能的吸收和利用能力，延遲植株的生長發(fā)育、造成產(chǎn)量和質(zhì)量的下降[5-6]。光合作用是作物生長發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)，產(chǎn)量和品質(zhì)決定于其光合能力的大小，煙葉既是煙草植株的營養(yǎng)器官、又是其經(jīng)濟器官。因此，生理活性物質(zhì)對遭遇低溫脅迫煙草植株光合活性的影響是改善植物逆境抗性的重點關(guān)注之一。在前期研究中，比較了多種生理活性物質(zhì)對遭遇低溫逆境煙草抗性生理指標(biāo)的影響，并進行了成分的優(yōu)選；該研究就生理活性物質(zhì)復(fù)合制劑對煙草光合作用的影響進行初步探討，以期為該復(fù)合制劑對煙草低溫耐性的改善提供依據(jù)。

1　材料與方法

試驗在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)中國煙草中南試驗站進行，利用人工氣候室（AGC-D003N，浙江大學(xué)求是人工環(huán)境有限公司）模擬早春低溫氣候條件進行低溫脅迫處理，選用甜菜堿、水楊酸、5-氨基乙酰丙酸、脫落酸、錳（Mn）、鋁（Co）、鉬（Mo）等微量元素和表面活性劑調(diào)配制成復(fù)合制劑。

1.1試驗材料

試驗材料K326、云87由中南煙草試驗站提供。采用漂浮育苗法育苗，播種出苗后，3～4片真葉期移植至裝填有漂浮育苗基質(zhì)的塑料花盆（20 cm×25 cm），依照煙草育苗技術(shù)進行肥水管理，選用生長旺盛、長勢基本一致的6～7片真葉盆栽幼苗供試驗用。

1.2低溫脅迫處理

將6～7片葉齡的盆栽煙草幼苗移入人工氣候室常溫馴化3 d（25℃、5 000 lx、光照 12 h），生理活性物質(zhì)復(fù)合制劑葉面噴施處理煙草幼苗24 h后（噴施清水為對照），開始低溫逆境處理7 d（8℃、1 000 lx、光照 12 h）；低溫處理結(jié)束后恢復(fù)常溫生長10 d，處理期間肥水供應(yīng)適宜。

1.3觀測指標(biāo)與方法

1.3.1生長情況觀察 低溫處理期間第 0、0.5、1、2、3、5和7天觀察煙苗的低溫逆境響應(yīng)（萎蔫程度、冷害癥狀），常溫恢復(fù)期間的第5、10天，觀察煙苗的生長恢復(fù)情況。

1.3.2光合活性測定 低溫弱光照處理第0、1、3、5天和常溫恢復(fù)期間第5、10天的中午，使用LI-6400型便攜式光合系統(tǒng)分析儀（美國LI-COR 公司），測定5株煙苗倒4、或5葉片的凈光合速率（Pn）、胞間CO2濃度（Ci）和氣孔導(dǎo)度（Gs）等光合活性參數(shù)指標(biāo)[7]；測定條件如下：紅藍光源、光量子通量密度為1 000 μmol/m2?s、氣孔速率為0.5、CO2濃度為400 μmol/mol。

1.3.3葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定 使用葉綠素?zé)晒鈨x（PAM-2000、Walz、Germany）測定煙苗葉片葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)，測定5株煙苗倒4、或5葉、每張葉片測定3點（與光合作用參數(shù)測定同時進行）[7]。葉片暗適應(yīng)處理30 min、測定初始熒光（Fo）后，再用飽和脈沖光[1 000 μmol/（m2?s）]測定最大熒光（Fm）；然后用光化光[400 μmol/（m2?s）、脈沖時間0.7 s、照射間隔20 s]測定葉片在光適應(yīng)狀態(tài)下的熒光值（Fo'）和最大熒光（Fm'），直至Fo'和Fm'趨于穩(wěn)定值為止（約重復(fù)測定15次）。依照相應(yīng)公式計算熒光參數(shù)[8]，SII最大光化學(xué)量子效率：Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm、PSII光化學(xué)量子效率ΦPSII=（Fm'-Fs）/Fm'、非光化學(xué)淬滅系數(shù)：NPQ=（Fm-Fm'）/Fm'、電子傳遞速率：ETR=PPFD×ΦPSII×0.84×0.5。

1.3.4數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用Excel 2007和SPSS軟件處理測定數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析。

2　結(jié)果與分析

2.1復(fù)合制劑對煙苗低溫脅迫響應(yīng)及常溫恢復(fù)狀況的影響

在低溫處理第0、0.5、1、2、3、5、7天觀察煙苗的萎蔫程度、冷害癥狀，常溫恢復(fù)第5、10天觀察煙苗的生長恢復(fù)情況（表1）。從參試兩品種煙苗的低溫逆境脅迫響應(yīng)來看，對照組煙苗低溫脅迫處理第2天開始有性狀表現(xiàn)，部分植株整株表現(xiàn)輕度萎焉（圖1 A），低溫處理第3～5天時部分植株芯葉和幼葉出現(xiàn)邊緣褶皺、云87的少數(shù)植株幼葉出現(xiàn)了水漬斑；而復(fù)合制劑處理煙苗，其形態(tài)方面基本無變化，植株挺立如常（圖1 B）。另外，低溫處理后續(xù)的常溫恢復(fù)期間，復(fù)合制劑處理組植株葉色常綠，第5天時呈現(xiàn)生長恢復(fù)狀態(tài)、后期的長勢較好；而對照組植株第5天時的生長恢復(fù)狀態(tài)比較“遲鈍”，第10天觀察時部分植株的下部葉輕度退綠現(xiàn)黃、或黃化脫落，呈現(xiàn)出了低溫“傷害”的癥狀。復(fù)合制劑處理和對照幼苗的低溫逆境脅迫響應(yīng)和常溫生長恢復(fù)狀況的差異，初步說明了復(fù)合制劑處理對煙草幼苗低溫抗性具有一定的改善效果。

表1　復(fù)合制劑對煙草低溫逆境脅迫響應(yīng)和常溫生長恢復(fù)狀況的影響

圖1　煙草幼苗低溫逆境脅迫響應(yīng)

2.2復(fù)合制劑對低溫脅迫及常溫恢復(fù)期煙苗光合活性的影響

低溫逆境脅迫對植物葉片光合作用的影響涉及的主要方面有光能吸收、氣體交換、碳固定過程等多個環(huán)節(jié)，將顯著影響葉片光合作用的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr）等光合作用參數(shù)。低溫逆境脅迫和常溫生長恢復(fù)期間煙草幼苗葉片光合活性的測定結(jié)果（表2）顯示，低溫逆境處理期間，葉片的Pn、Gs、Ci和Tr均顯著降低，且隨著低溫逆境脅迫的延伸持續(xù)下降；低溫處理后的常溫恢復(fù)生長時期，葉片的光合活性參數(shù)均得到了較好的恢復(fù)，但時至第10天時，這些光合作用參數(shù)仍然沒有恢復(fù)到處理前的水平，這說明了低溫脅迫對煙草幼苗葉片光合系統(tǒng)產(chǎn)生了一定的低溫“傷害”，且“傷害的修復(fù)”在隨后的正常生長條件下會持續(xù)較長時期。另一方面，在同樣低溫逆境條件下，復(fù)合制劑處理的光合參數(shù)變化均優(yōu)于對照組，常溫生長期間的恢復(fù)程度亦優(yōu)于對照（參試兩品種的變化趨勢類似）。

表2　復(fù)合制劑處理對煙草幼苗葉片光合活性的影響

植物葉片的凈光合速率是葉綠體內(nèi)光反應(yīng)（PSII、PSI光能吸收、電子傳遞）和暗反應(yīng)（卡爾文循環(huán)碳固定）的“綜合”結(jié)果；氣孔是葉片與外界交換O2、CO2和水蒸氣的主要通道，通過調(diào)節(jié)其張開程度（氣孔導(dǎo)度）在損失水分較少的條件下獲取最多量的CO2用于光合作用；胞間CO2濃度取決于葉片周圍空氣的CO2濃度、氣孔導(dǎo)度、葉肉導(dǎo)度和葉肉細胞的光合活性這四個方面的因素，研究中試驗材料處于同一環(huán)境條件，因此其胞間CO2濃度主要取決于氣孔導(dǎo)度和葉肉細胞的光合活性。結(jié)果表明，復(fù)合制劑處理植株的氣孔導(dǎo)度大于對照、而胞間CO2濃度低于對照，這一結(jié)果暗示了對照植株葉肉細胞的光合活性低于復(fù)合制劑處理植株；因此，推測復(fù)合制劑可能對遭遇低溫逆境煙草植株光合系統(tǒng)的D1、D2蛋白及卡爾文循環(huán)中的某些酶類具有“保護”作用，從而減輕了低溫逆境脅迫對煙苗光合作用的抑制效果。

2.3復(fù)合制劑對低溫脅迫和常溫恢復(fù)期煙苗葉綠素?zé)晒獾挠绊?/p>

葉綠素?zé)晒鈪?shù)作為植物抗逆反應(yīng)的指標(biāo)之一，用于植物的耐逆境能力鑒定評價方面得到廣泛的應(yīng)用和認可[9]。低溫逆境脅迫和常溫生長恢復(fù)期間煙草葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)檢測結(jié)果見表3。

表3　復(fù)合制劑處理對煙草植株葉片光合系統(tǒng)葉綠素?zé)晒獾挠绊?/p>

從表3可以看出，低溫脅迫明顯降低了煙草幼苗葉片的光能利用能力，降低了PSII的最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、量子產(chǎn)量（ΦPSII）和表觀電子傳導(dǎo)率（ETR），而增大了非光化學(xué)猝滅系數(shù)（NPQ），且隨著低溫逆境處理時間越長、影響越大；常溫生長恢復(fù)期內(nèi)，葉綠素?zé)晒鈪?shù)得以較快的恢復(fù)，但第10天時仍與低溫處理前存在明顯的差異。另一方面，在同樣低溫逆境條件下，復(fù)合制劑處理植株的葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化均優(yōu)于對照組，常溫生長期間的恢復(fù)程度亦優(yōu)于對照。煙草葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化，與2.2葉片光合作用參數(shù)的變化趨勢相匹配，從另一個角度較好的驗證了復(fù)合制劑對煙草葉片光合作用低溫抑制的減輕效果。

從常溫期間的恢復(fù)“效果”來看，對照植株的Fv/Fm和NPQ的恢復(fù)程度均低于復(fù)合制劑處理植株，說明了對照植株光能吸收能力的下降，不僅是因其非光化能量耗散（光保護反應(yīng)）、還有部分原因是由于光合系統(tǒng)蛋白（如PSII D1、D2蛋白）的低溫“傷害”程度更大或修復(fù)受阻所致；因此可以細胞微觀層面來推斷復(fù)合制劑對葉片光合系統(tǒng)具有保護作用。

4　小結(jié)與討論

溫度是影響植物光合作用的主要因素之一，不良的環(huán)境溫度（高溫或低溫）對光合作用有明顯的抑制作用。試驗結(jié)果表明，在遭遇低溫逆境脅迫時，葉面噴施復(fù)合制劑具有明顯改善煙草植株的低溫逆境響應(yīng)和光合活性、提高煙草植株低溫抗性的生理效果；但在復(fù)合制劑的后續(xù)研究中，需對煙草植株低溫逆境抗性的改善效果經(jīng)大田試驗驗證。

如前2.2所述，復(fù)合制劑減輕低溫逆境脅迫對煙苗光合作用的抑制效果，可能與其對光合系統(tǒng)的某些蛋白具有“保護”作用有關(guān)。因此，可通過檢測低溫逆境脅迫期間復(fù)合制劑對卡爾文循環(huán)中的某些調(diào)節(jié)酶（如FBPase、SBPase、Rubisco）活性的影響來進一步確認復(fù)合制劑減輕低溫逆境脅迫對煙苗光合作用的抑制效果。同時，植物遭遇低溫逆境脅迫時，光合系統(tǒng)由于低溫光抑制的影響，其積累的過剩光能與O2富集供應(yīng)將使葉綠體產(chǎn)生多量的活性氧，將導(dǎo)致光合作用的光抑制、甚至光氧化、光破壞，加劇低溫逆境對植物的“傷害”[10-12]；另外，當(dāng)遭遇逆境脅迫時，植物會調(diào)整自身代謝、強化專一的生理代謝。鑒于生理活性物質(zhì)對植物代謝具有調(diào)節(jié)作用，因此在后續(xù)試驗中，需檢驗復(fù)合制劑處理對煙草植株生理生化指標(biāo)的影響。

植物生理活性調(diào)節(jié)物質(zhì)可明顯影響煙草的生長發(fā)育，而復(fù)合制劑系多種生理活性物質(zhì)調(diào)制而成；因此，在后續(xù)大田試驗時需制備烤煙樣品，進行主要烤煙品質(zhì)成分指標(biāo)的檢測分析，以確認復(fù)合制劑對煙草品質(zhì)方面的影響。

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（責(zé)任編輯：高國賦）

Effects of Physiological Active Substance Compound Preparation on Photosynthetic Activity of Tobacco Plants under Chilling Stress

LOU Zhen-hua1，GAO Zhi-qiang1，ZHANG Hong-bing1，XIE hui-ya1，ZHOU yi1，HE Li-xiong2，SHI Duan-fu3
（1.Zhuzhou Branch of Tobacco Company in Hunan Province, Changsha 412000, PRC; 2.College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 3.College of Resources and Environment, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

Abstract：K326 and Yun87 were used to investigate the improvement effects of plant physiological active substance compound preparation on the photosynthetic activity of tobacco plants under chilling stress in this research.The results showed that both the response to chilling stress and the recovery at normal temperature of plants treated by compound preparation were significantly better than the control plants, as the index including net photosynthetic rate (Pn), stomatal conductance (Gs), and intercellular CO2concentration (Ci), transpiration rate (Tr) and chlorophyll fluorescence parameters involving the maximal photochemical efficiency (Fv/Fm), PSII quantum yield (ΦPSII), apparent electron transport rate (ETR) and non-photochemical quenching (NPQ) indicated.This compound preparation could decrease chilling-induced photoinhibition, and improve chilling resistance of tobacco.

Key words：tobacco; physiological active substance; chilling stress; photosynthesis

通訊作者：史瑞甫

作者簡介：羅真華 （1968-），男，湖南炎陵縣人，經(jīng)濟師，主要從事煙葉生產(chǎn)經(jīng)營及技術(shù)推廣。

基金項目：湖南省煙草公司株洲市分公司科技開發(fā)項目（13-008）

收稿日期：2015-09-02

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.12.008

中圖分類號：S572

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-060X（2015）12-0025-04