頭孢喹肟與馬立克病疫苗聯(lián)用的試驗觀察

許秋陽，束陳宇，王義敏，張小榮，吳艷濤

（揚州大學農(nóng)業(yè)部禽用生物制劑創(chuàng)制重點實驗室，江蘇 揚州225009）

雞白痢沙門菌是導致雛雞早期死亡的主要病原菌之一，可通過垂直傳播和水平傳播感染雞群，造成嚴重的經(jīng)濟損失。研究資料表明，頭孢菌素類抗生素可有效防治雛雞的早期死亡[1]。20世紀90年代，國內(nèi)外就已報道在馬立克病疫苗中添加頭孢噻呋不會影響疫苗的效價[2-4]。頭孢喹肟[5-6]（Cefquinome）是第4代動物專用頭孢菌素類抗生素，與頭孢噻呋相比具有抗菌活性強、抗菌譜廣、β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定、吸收快和體內(nèi)殘留小等優(yōu)點，已得到越來越廣泛的應(yīng)用。本試驗將評價頭孢喹肟加入到馬立克病疫苗中對預防雞白痢沙門菌感染的效果，以及對馬立克病疫苗效價的影響，為頭孢喹肟和馬立克病疫苗在1日齡雛雞聯(lián)用的可行性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 頭孢喹肟，由揚州大學獸醫(yī)學院藥理組提供；雞白痢沙門菌標準菌株C79-13和馬立克病疫苗（CVI988/Rispens株）由揚州大學農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學重點開放實驗室保存；M199細胞培養(yǎng)基和小牛血清，購自Hyclone公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和S.S.瓊脂，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 頭孢喹肟對馬立克病疫苗效價的影響 向9份稀釋好的馬立克病疫苗（3 500 PFU/0.2mL）中加入頭孢喹肟至不同終濃度（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mg/mL），混勻后置于25℃，在30 min、45min和60min 3個時間點對各組混合液進行取樣，按照文獻[9]，采用病毒蝕斑計數(shù)法進行疫苗效價測定。每個頭孢喹肟濃度接種5個生長于35mm培養(yǎng)皿的雞胚成纖維細胞，每個培養(yǎng)皿接種2μL。37℃吸附1 h后，每皿加入維持液3 mL。將培養(yǎng)皿置于5%CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)5 d后進行病毒蝕斑計數(shù)。

1.3 頭孢喹肟對人工誘發(fā)雞白痢的預防效果 將雞白痢沙門菌標準菌株C79-13接種于營養(yǎng)肉湯中，于37℃培養(yǎng)12 h，4℃保存。以1mL/羽的量感染雞，從病死雞中分離并鑒定C79-13，重復兩次，增強細菌致病力。將菌液稀釋至108CFU/mL，測定LD50，確定接種劑量為0.3mL。

將120只1日齡雛雞隨機平均分為5組。設(shè)頭孢喹肟高劑量組（1mg/mL）、中劑量組（0.5mg/mL）、低劑量組（0.25mg/mL）、陽性對照組和陰性對照組。3個給藥組于1日齡注射相應(yīng)濃度的頭孢喹肟-馬立克病疫苗混合液0.2 mL，陽性對照組和陰性對照組注射生理鹽水0.2mL。免疫2 h后，3個給藥組及陽性對照組按照預試驗確定的劑量接種雞白痢沙門菌標準菌株C79-13。雞群繼續(xù)飼養(yǎng)10 d，觀察各組雞的臨床癥狀及死亡情況。臨床癥狀觀察主要包括精神狀態(tài)、食欲和糞便等。對死亡雞進行剖檢，觀察病理變化，并進行細菌分離。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)顯著性檢驗，各組間病毒蝕斑變化差異采用t檢驗；發(fā)病率和死亡率采用X2檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 頭孢喹肟對病毒蝕斑的影響 頭孢喹肟添加到稀釋好的馬立克病疫苗中，對疫苗效價的影響結(jié)果見圖1。利用統(tǒng)計軟件分析，結(jié)果顯示，在稀釋好的疫苗病毒液中添加0.5mg/mL頭孢喹肟，室溫放置30min和45min對疫苗效價沒有顯著影響，但作用60min后疫苗效價與未添加藥物組相比有所下降，且差異顯著（P＜0.05）。隨著添加藥物濃度的提高，疫苗效價的下降程度越來越嚴重，且隨著作用時間的延長，這種負面影響也越趨明顯，當添加藥物濃度達到4.0 mg/mL時，30 min之內(nèi)即可導致疫苗病毒幾乎完全失活。

圖1 頭孢喹肟對馬立克病疫苗效價的影響

2.2 頭孢喹肟對雞白痢的預防效果 陽性對照組在感染后的第1天出現(xiàn)臨床癥狀，第3天開始大量死亡，第7天后逐漸停止。低劑量組的發(fā)病時間與陽性對照組同步，但發(fā)病率和死亡率較低。高劑量組和中劑量組的發(fā)病和死亡出現(xiàn)的都較晚，與低劑量組相比發(fā)病率和死亡率均存在極顯著差異（P＜0.01），但高劑量組與中劑量組之間不存在統(tǒng)計學差異。結(jié)果見表1。結(jié)合頭孢喹肟對疫苗效價影響試驗的結(jié)果，0.5mg/mL為頭孢喹肟的最適添加量，在不降低疫苗效價的同時能有效的預防雞白痢。高于該劑量時，雖然能有效預防雞白痢，但疫苗效價降低明顯；低于該劑量時，對疫苗效價雖無影響，但不能預防雞白痢。

表1 頭孢喹肟對人工誘發(fā)雞白痢的預防效果

3 討論

頭孢喹肟作為第4代動物專用頭孢菌素類抗生素，已廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)[8]。Deshpande等比較了頭孢喹肟和頭孢噻呋對臨床分離的埃希大腸桿菌、克雷伯氏桿菌的抗菌活性。結(jié)果顯示，頭孢喹肟比頭孢噻呋具有更強的抗菌活性[6]。雞白痢是一種常見傳染病，發(fā)病率和死亡率都較高，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大損失。目前，頭孢菌素類抗生素是預防和治療該病主要藥物。為了控制成本、減少應(yīng)激，養(yǎng)殖者通常將頭孢菌素與馬立克病疫苗聯(lián)合使用。有研究表明，在馬立克病疫苗中適量添加頭孢噻呋不會造成疫苗效價的下降，但超過了推薦使用量后，則會導致疫苗效價的顯著降低[9]。本試驗結(jié)果顯示，按照0.5mg/mL（0.1mg/羽），存放時限不超過45min的條件使用，頭孢喹肟不會降低疫苗的效價，而且能有效預防雞白痢。這與劉穎、莊景新等對頭孢噻呋與馬立克病疫苗聯(lián)用的研究結(jié)果相似；與王付民等對頭孢噻呋預防雞白痢的試驗結(jié)果相比，相同劑量下頭孢喹肟對雞白痢的預防效果好于頭孢噻呋。我們建議凈化達標、安全措施完善的規(guī)模養(yǎng)殖場，盡量不要在馬立克病疫苗中添加任何藥物。對于條件有限的養(yǎng)殖者，頭孢喹肟與馬立克病疫苗聯(lián)用顯得更有意義。這不僅可以減少勞動量，而且能夠有效地保證雛雞的存活率，減少損失。

[1]王付民，胡功政.頭孢噻呋對實驗性感染雞白痢沙門氏菌病的藥效學研究[J].中國獸藥雜志，2007（04）：46-48.

[2]程海兵，梁志勇，董文權(quán).對1日齡雛雞進行速解靈與液氮馬立克疫苗混合注射[J].中國家禽，2006（09）：20-21.

[3] Eidson，C S，Kleven SH，Anderson D P.Effect of antibiotics on turkey herpesvirus vaccine[J].Poult Sci，1973，52（2）：755-760.

[4]吳長新，甘軍紀，高以明.抗菌藥對馬立克氏病活疫苗毒性的作用[J].中國獸醫(yī)學報，1999（03）：10-12.

[5]Murphy SP，Erwin M E，Jones RN.Cefquinome（HR111V）.In vitro evaluation of a broad-spectrum cephalosporin indicated for infections in animals[J].Diagn Microbiol Infect Dis，1994.20（1）：49-55.

[6]Deshpande L，Pfaller M A，Jones R N.In vitro activity of ceftiofur tested against clinical isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae including extended spectrum beta-lactamase producing strains[J].Int JAntimicrob Agents，2000，15（4）：271-275.

[7] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典.三部[M].2010版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010.

[8] Tell，L L.Harrenstien S.Wetzlich，et al.Pharmacokinetics of ceftiofur sodium in exotic and domestic avian species[J].JVet Pharmacol Ther，1998.21（2）：85-91.

[9]張小榮，許秋陽，王義敏.超量添加頭孢噻呋對馬立克氏病疫苗的危害性評估[J].中國家禽，2012（24）：63-64.