綿羊肺炎支原體p128基因序列分析及原核表達

馮旭飛，刀筱芳，張賢宇，李定霏，楊發(fā)龍

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都610041；2.成都市水生動物檢疫檢驗站，四川 成都610071）

綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae）是引起綿羊、山羊特別是羔羊增生性間質(zhì)性肺炎的主要病原。此外，羊感染綿羊肺炎支原體后，對多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌以及副流感病毒等病原的易感性增加[1-3]。該病原在全球范圍內(nèi)均有分布，在我國流行也十分廣泛，給養(yǎng)羊業(yè)造成了較大的經(jīng)濟損失。

粘附素是支原體主要的毒力因子和免疫原，其介導(dǎo)支原體對宿主靶細胞的粘附和致病過程，同時也可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。因此，支原體的粘附素已經(jīng)成為建立ELISA等血清學(xué)診斷技術(shù)和開發(fā)重組亞單位疫苗的重要候選蛋白分子。Niang等人的研究已表明，綿羊肺炎支原體同樣可以粘附到呼吸道上皮細胞，導(dǎo)致纖毛運動停滯，進一步造成纖毛破壞和脫落[4]。但目前對綿羊肺炎支原體中與粘附功能相關(guān)的分子尚不清楚。基于16S rRNA基因和HSP70基因的遺傳進化分析表明，綿羊肺炎支原體與豬肺炎支原體具有最為相近的親緣關(guān)系[5-6]。在豬肺炎支原體中，P97是最為重要的粘附素分子。P146是P97/P102家族成員之一，研究已表明其同樣可以粘附豬氣管纖毛，是另一重要的粘附分子，同時也是主要的免疫原之一[7]。在綿羊肺炎支原體SC01株基因組中[8]，經(jīng)分析，發(fā)現(xiàn)一編碼產(chǎn)物與豬肺炎支原體p146高度同源的基因，推測其編碼蛋白的分子量為128 ku，故暫命名為P128蛋白。為了深入研究該蛋白的功能，本研究在對其進行基因序列分析的基礎(chǔ)上，進行了原核表達，旨在為下一步深入研究其功能以及開發(fā)血清學(xué)診斷技術(shù)和亞單位疫苗提供有用的試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及血清 綿羊肺炎支原體SC01株由本實驗室（西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實驗室）分離鑒定和保存；pMD19-T載體、TOP 10、JM109、Rosetta（DE 3），均購自寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；pET-41 a（+）載體為Novagen公司產(chǎn)品；兔抗綿羊肺炎支原體SC01株陽性血清及陰性血清均由本實驗室制備。

1.2 主要試劑 Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶均購自寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；AxyPrepTMDNAGel Extraction Kit、AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit均為Axygen公司產(chǎn)品；Histrap HP重組蛋白純化柱為GE Healthcare公司產(chǎn)品；Immun-Star WesternC Chemiluminescence Kit為Bio-Rad公司產(chǎn)品。1.3 p128基因序列分析 核苷酸及氨基酸序列的同源性比較和分析采用NCBI的BLAST工具；蛋白跨膜區(qū)、信號肽及脂蛋白預(yù)測分別利用在線工具TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、SigalP 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）以及（http：//www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/）完成?？乖苑治霾捎迷诰€分析站點（http：//imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl）進行。

1.4 引物設(shè)計 根據(jù)綿羊肺炎支原體SC01株p128基因序列，采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計了一對引物：p128 F/p128R，引物擴增片段大小為546 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。其序列如下：

P128 F：5′-CGGGATCCTTAATATTAGCATTGACC-3′（下劃線為BamH I酶切位點）；

P128 R：5′-CCCAAGCTTCACTAAAATCTGTT CTTCT-3′（下劃線為Hind III酶切位點）。

1.5 目的片段的PCR擴增 采用常規(guī)酚/氯仿法提取綿羊肺炎支原體SC01株基因組DNA作為模板，利用上述引物P128 F/p128R進行PCR擴增。反應(yīng)總體系為25μL，包含10×PCR Buffer 2.5μL、dNTP（各2.5mmol/L）2μL、MgCl2（25mmol/L）2μL、上下游引物（10μmol/L）各1μL、Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.125μL、DNA模板2μL用無菌水補足25μL。反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃30 s，58℃45 s，72℃45 s，35個循環(huán)；72℃10min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.6 原核表達載體的構(gòu)建 將PCR擴增的p128基因與pMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP 10，提取重組質(zhì)粒進行鑒定，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序并將重組質(zhì)粒命名為pMDp128。將測序正確的pMD-p128以及pET-41（a+）載體分別用Bam H I和Hind III雙酶切，膠回收目的片段，連接轉(zhuǎn)化到JM109，經(jīng)菌液及PCR鑒定為陽性的送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。

1.7 重組蛋白的誘導(dǎo)表達、可溶性分析 將上述鑒定正確的重組陽性質(zhì)粒pET-41（a+）-p128轉(zhuǎn)化至表達工程菌E.coli Rosetta（DE3）中，挑選陽性菌落接種到LB肉湯中培養(yǎng)至OD600nm為0.6后，加入0.2 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)表達3 h，并采用超聲破碎儀進行超聲裂解。用SDS-PAGE對重組蛋白表達情況及其可溶性進行電泳分析。

1.8 Western-blot分析 按照包涵體純化方法對重組蛋白進行純化，以1∶300稀釋的一抗（兔抗綿羊肺炎支原體陽性血清）和1∶5 000稀釋的二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG）按照Western blot操作方法進行重組蛋白的鑒定。

2 結(jié)果

2.1 分子特征分析 對p128基因進行序列分析結(jié)果表明，p128基因CDS全長3 426 bp，G+C含量為31.03%，其中含3個TGA密碼子（在支原體基因組中上編碼色氨酸），分別位于1 999 bp、2 356 bp、2 740 bp堿基處。該基因共編碼1 141個氨基酸，核酸分子量為128 484.5，其蛋白分子量為127.95 kDa。經(jīng)BLAST比較分析，p128基因與豬肺炎支原體黏附素基因p146相似性最高，兩者間核苷酸序列的相似性為73%，氨基酸序列的相似性為53%。

TMHMM、SignlP 4.0和LipoP 1.0在線工具分析的結(jié)果表明，P128蛋白主要錨定于細胞膜外，在其N端7-29氨基酸之間，有一明顯的跨膜區(qū)螺旋（圖1），無非脂蛋白信號肽（圖2），在第23-24氨基酸之間出現(xiàn)一個脂蛋白信號肽酶裂解位點。抗原表位分析顯示，P128蛋白包含豐富的抗原表位，通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)其包含35個可能的抗原表位。平均抗原趨向性為1.0075。

圖1 P128跨膜結(jié)構(gòu)分析

圖2 P128脂蛋白分析

2.2 綿羊肺炎支原體p128基因的擴增結(jié)果 綿羊肺炎支原體p128基因的PCR擴增片段在546 bp左右出現(xiàn)一條特異性條帶，該片段與預(yù)期的目的條帶大小相符，陰性對照未出現(xiàn)擴增（圖3）。

圖3 PCR擴增結(jié)果

2.3 原核表達載體的構(gòu)建及鑒定 重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定與預(yù)期結(jié)果一致，質(zhì)粒PCR擴增獲得特異性條帶（圖4）表明表達載體構(gòu)建正確。

圖4 重組質(zhì)粒的PCR鑒定

2.4 重組蛋白的表達和可溶性分析 對重組蛋白進行電泳分析，結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在50 ku～75 ku之間出現(xiàn)明顯的表達條帶，其大小與預(yù)期（54.83 ku）相符（圖5）；該重組蛋白以包涵體形式進行表達（圖6）。

2.5 Western-blot分析結(jié)果 Western-blot檢測結(jié)果表明，重組蛋白可與綿羊肺炎支原體陽性血清特異性結(jié)合，而陰性血清無條帶（圖7）。表明P128蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

圖5 P128的誘導(dǎo)表達

圖6 表達產(chǎn)物的可溶性分析及純化

圖7重組蛋白的Western blot分析

3 討論

與絲狀支原體簇成員等其他羊致病性支原體相比，綿羊肺炎支原體分子生物學(xué)特性方面的研究相對滯后，其毒力因子及重要免疫原蛋白的研究尚不夠深入。此前國內(nèi)外多個學(xué)者先后采用雙向電泳、SDS-PAGE以及免疫印跡等方法對綿羊肺炎支原體的免疫原蛋白組成和大小進行了初步分析[9-10]。針對特定的功能蛋白和編碼基因及其結(jié)構(gòu)和功能的研究相對較少。

Bogema等人[7]對豬肺炎支原體p146進行原核表達后獲得重組P146蛋白并進行粘附試驗，經(jīng)多次重復(fù)，證明P146是一個具有多種功能的粘附素；同時證實，P146蛋白可以與免疫動物、耐過動物以及人工感染動物的血清均可以發(fā)生明顯的結(jié)合反應(yīng)，說明在這些血清中存在P146的抗體，從而證明P146是良好的免疫原。本文對綿羊肺炎支原體p128基因序列的分析結(jié)果表明，P128蛋白的編碼基因與豬肺炎支原體粘附素蛋白P746的基因高度同源，兩者間核苷酸序列的相似性為73%，編碼氨基酸序列的相似性為53%，說明p128為p146的直系同源基因。為研究該蛋白的功能，本研究對編碼綿羊肺炎支原體p128的部分基因片段進行了克隆，并成功在大腸桿菌中以包涵體的形式得到表達。利用兔抗綿羊肺炎支原體全菌抗體進行免疫印跡分析，結(jié)果顯示，純化得到的重組蛋白能與兔抗全菌抗體特異性結(jié)合，表明用綿羊肺炎支原體免疫家兔后，家兔能產(chǎn)生針對P128蛋白的抗體，提示P128是綿羊肺炎支原體的免疫原之一；這同時也說明本研究所表達的重組蛋白可以作為抗原，在ELISA等綿羊肺炎支原體血清抗體檢測試劑盒的研制和亞單位疫苗的開發(fā)等方面具有潛在的應(yīng)用價值。但P128在綿羊肺炎支原體中是否也是參與粘附過程的一個粘附素有待進一步的研究。

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