新生霉素衍生物FM-NOV17抑制Her2+乳腺癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制

柯春林， 林　帥， 田　崛， 柯　方， 吳麗賢

新生霉素衍生物FM-NOV17抑制Her2+乳腺癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制

柯春林1， 林帥2， 田崛2， 柯方3， 吳麗賢2

摘要:目的研究新生霉素衍生物FM-NOV17對乳腺癌Skbr3細(xì)胞的作用，并探討該作用是否與其干擾熱休克蛋白90(Hsp90)分子伴侶的功能從而促進(jìn)Her2降解有關(guān)。方法用蛋白免疫印跡法檢測Her2的含量，采用免疫共沉淀的方法研究FM-NOV17對乳腺癌細(xì)胞Hsp90分子伴侶功能的影響。用免疫共沉淀的方法將Her2與其分子伴侶復(fù)合物沉淀下來，用免疫印跡法檢測沉淀物中與Her2結(jié)合的Hsp90和輔伴侶Hsp70含量的變化。結(jié)果FM-NOV17能降低乳腺癌細(xì)胞Skbr3中Her2的蛋白水平，F(xiàn)M-NOV17使Her2與Hsp90和Hsp70的結(jié)合減少，降低Her2蛋白水平，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡。結(jié)論FM-NOV17通過干擾Hsp90伴侶功能，減少Her2與Hsp90和輔伴侶的結(jié)合，降低Her2蛋白量，最終抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。

關(guān)鍵詞:新生霉素； 蛋白質(zhì)類； Hsp90熱休克蛋白質(zhì)類； 熱休克蛋白質(zhì)類； 分子監(jiān)控蛋白類； 乳腺腫瘤/細(xì)胞學(xué)

熱休克蛋白90(Hsp90)是細(xì)胞中高度保守的一類蛋白，作為分子伴侶對正常細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞中眾多蛋白的構(gòu)象成熟和功能活性進(jìn)行調(diào)控，該分子伴侶功能受Hsp90與輔伴侶的相互作用所調(diào)節(jié)[1]。在腫瘤細(xì)胞中，Hsp90的活性比正常細(xì)胞高100倍，與腫瘤細(xì)胞高速增殖的需要相匹配，已確定的客戶蛋白(client protein)超過100個[2]。Her2是乳腺癌的主要致病相關(guān)基因，20%~30%的乳腺癌患者存在Her2過度表達(dá)。Her2基因擴(kuò)增是乳腺癌預(yù)后差的獨(dú)立評估因子，不論淋巴結(jié)是否陽性，Her2陽性的乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險遠(yuǎn)高于其他人群[3]。由于Her2是Hsp90的客戶蛋白之一，因此,通過抑制Hsp90的分子伴侶功能從而促進(jìn)Her2蛋白降解就很有可能同時阻斷Her2激活的多條與乳腺癌增殖、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路，如Her2-PI3K-AKT通路。

由于Hsp90在腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及其預(yù)后都扮演著重要的角色，具有“一靶多效”的作用，因此近年來Hsp90已成為抗腫瘤藥物作用的重要靶點(diǎn)，許多大制藥公司紛紛針對Hsp90設(shè)計和合成新化合物，有些已經(jīng)進(jìn)入臨床研究[4]。按照結(jié)合和作用的位點(diǎn)不同，Hsp90抑制劑可分為N-末端抑制劑、C-末端抑制劑、結(jié)合位點(diǎn)未明確的抑制劑、調(diào)節(jié)輔伴侶功能的抑制劑和調(diào)節(jié)Hsp90翻譯后修飾的抑制劑[5]。新生霉素(NOV)是香豆素類抗生素，具有較好的水溶性，除了有抗菌作用，NOV還是Hsp90的C-末端抑制劑，在體內(nèi)外還能夠抑制多種癌細(xì)胞的增殖，但其活性較低[6-9]，對白血病K562細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)高達(dá)500 μmol/L[10]。為了提高NOV的抗腫瘤活性，合成具有藥用價值的新型化合物，本課題組以NOV為母體化合物進(jìn)行各種方式的改造，獲得一系列新型衍生物，通過體外腫瘤細(xì)胞抗腫瘤活性的篩選，獲取了活性較強(qiáng)的幾個化合物，其中FM-NOV17活性和溶解性均較好，具有一定的成藥性。本研究以Hsp90經(jīng)典抑制劑格爾德霉素(Geldanamycin, GA)為陽性對照藥，試圖探討FM-NOV17能否下調(diào)Her2高表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞株Skbr3，并進(jìn)一步分析該作用機(jī)制是否與其阻斷Hsp90伴侶功能、促進(jìn)Her2降解有關(guān)，試圖進(jìn)一步為FM-NOV17的體內(nèi)抗乳腺癌的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料化合物FM-NOV17由本課題組合成，合成過程如下：在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在50 mL反應(yīng)瓶中依次加入1.480 g(10 mmol)鄰苯二甲酸酐、0.75 g(10 mmol)甘氨酸，于20 mL水中100 ℃反應(yīng)1 h，冷卻至室溫后，抽濾，得2.000 g白色固體2-[(羧甲基)氨基甲酰]苯甲酸，產(chǎn)率90%。然后在100 mL反應(yīng)瓶中依次加入1.67 g(10 mmol)5-硝基水楊醛、2.230 g(10 mmol)2-[(羧甲基)氨基甲酰]苯甲酸、1.641 g(20 mmol)無水乙酸鈉和30 mL乙酸酐，120 ℃反應(yīng)4 h，冷卻至室溫后，抽濾，得3.186 g白色固體NOV17，產(chǎn)率90%，純度96%以上，溶解于DMSO，制備成10 mmol/L的母液備用。陽性對照藥GA(美國Stressgen公司)溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，配成儲存液1 mmol/L備用；稱取250 mg MTT(美國Sigma公司)，加入50 mL PBS (0.01 mol/L，pH=7.4)攪拌30 min后，4 ℃避光儲存。Hsp90單克隆抗體(美國Stressgen公司)，Hsp27、p23、p60HOP、Hsp70單克隆抗體(美國Cell Signal公司)，Her2、p-AKT、AKT、β-Actin單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞株Skbr3培養(yǎng)條件為含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清DMEM，青霉素(100 IU/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)，在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵育箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，接種細(xì)胞濃度為5×105mL-1。

1.2.2MTT法觀察FM-NOV17對乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用參照文獻(xiàn)[10]，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組、陽性對照組、不同濃度加藥組，每組設(shè)3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計算IC50。

1.2.3免疫共沉淀法參照文獻(xiàn)[10]，收集1×107Skbr3細(xì)胞裂解，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白。從總細(xì)胞蛋白中分離Her2/Hsp90/Hsp70蛋白復(fù)合物。40 μL Protein A-agarose用RIPA液洗滌3次，加入30 μL(200 mg/L)單抗，4 ℃搖床孵育過夜，離心，二級復(fù)合物洗滌3次，加入細(xì)胞總蛋白與該復(fù)合物4 ℃搖床孵育，收集三級復(fù)合物，與Her2偶聯(lián)的Hsp90和Hsp70也一起沉淀下來，所得蛋白復(fù)合物用Western-blot檢測。

1.2.4免疫印跡法檢測蛋白含量變化參照文獻(xiàn)[10]，提取藥物處理后的細(xì)胞總蛋白，定量，加等量蛋白于SDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，或用免疫共沉淀法所得樣品電泳。電泳后轉(zhuǎn)膜，加入封閉液封閉1 h后，加Her2、Hsp90、Hsp70、Hsp27、p23、p60HOP、p-AKT、AKT或β-Actin單抗室溫作用1 h或者過夜，洗去未結(jié)合的一抗，以Western-blot試劑盒加二抗，染色，拍照。

1.2.5FM-NOV17對乳腺癌細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響取對數(shù)生長期的Skbr3細(xì)胞，不同濃度的FM-NOV17處理Skbr3細(xì)胞48 h，收集Skbr3細(xì)胞；用75%冰冷的乙醇-20 ℃固定，用含50 μg/mL RNA酶和50 μg/mL碘化丙啶(PI)的PBS重懸細(xì)胞，避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測，采用Modifit軟件分析各個細(xì)胞周期時相的百分率。收集FM-NOV17處理的Skbr3細(xì)胞，用含有5 μL Annxin V-FITC和5 μL PI 的Binding Buffer避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測凋亡百分率。

2結(jié)果

2.1FM-NOV17對Skbr3細(xì)胞的抑制作用FM-NOV17的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖 1A所示。用MTT法檢測FM-NOV17處理24 h對Skbr3細(xì)胞的增殖抑制率，用GraphPad Prism 5軟件計算IC50。隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率也增加，呈量效關(guān)系，IC50為0.827 μmol/L(圖1B)。提示FM-NOV17對Her2陽性乳腺癌具有較強(qiáng)的抑制作用。

A：FM-NOV17 的化學(xué)結(jié)構(gòu)(354 Da)；B：FM-NOV17對Skbr3細(xì)胞作用24 h的量效關(guān)系. 圖1　FM-NOV17的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對Skbr3細(xì)胞的作用Fig 1　Chemical structure of FM-NOV17 and its effect on growth of Skbr3 cells

2.2FM-NOV17對Skbr3細(xì)胞中Her2蛋白及其下游AKT信號通路的影響FM-NOV17 1 μmol/L處理細(xì)胞24 h，可見Skbr3細(xì)胞中Her2蛋白明顯減少；其下游信號通路的AKT和p-AKT均減少(圖2)。說明FM-NOV17能夠有效減少Her2蛋白水平從而抑制其下游的AKT信號通路。

2.3FM-NOV17對Skbr3細(xì)胞中Her2/Hsp90/Hsp70復(fù)合物的影響

2.3.1FM-NOV17對Skbr3細(xì)胞中Her2/Hsp90結(jié)合的影響FM-NOV17短時間處理6 h可明顯抑制Her2/Hsp90蛋白復(fù)合物含量，使得與Hsp90結(jié)合的Her2減少。反之，用Her2單抗免疫共沉淀Her2/Hsp90復(fù)合物，得到相似的結(jié)果(圖3)。結(jié)果表明，在Her2蛋白含量減少之前，F(xiàn)M-NOV17就可抑制Hsp90伴侶功能，使Her2和Hsp90之間的相互結(jié)合減少，很可能使得Her2蛋白失去Hsp90的保護(hù)后被蛋白酶體迅速降解。

1.CTL；2.FM-NOV17 1 μmol/L；3.GA 5 μmol/L.　藥物處理Skbr3細(xì)胞24 h，用蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞內(nèi)Her2蛋白及其下游AKT信號水平.圖2　FM-NOV17對Skbr3細(xì)胞Her2蛋白及AKT的影響Fig 2　Effects of FM-NOV17 on Her2 protein level and AKT signal in Skbr3 cells

2.3.2FM-NOV17對乳腺癌Skbr3細(xì)胞Her2/Hsp70結(jié)合的影響FM-NOV17短時間處理6 h后，Her2蛋白和Hsp70蛋白的結(jié)合減少，這點(diǎn)作用也與N-末端抑制劑不同，GA可使Skbr3細(xì)胞中Her2和Hsp70的結(jié)合增加(圖3)。提示FM-NOV17對Hsp90伴侶功能的抑制作用與經(jīng)典的Hsp90 N-末端抑制劑不同。

2.3.3FM-NOV17對乳腺癌Skbr3細(xì)胞中Hsp90/Hsp70伴侶復(fù)合物的影響免疫共沉淀的結(jié)果表明，F(xiàn)M-NOV17可以抑制Hsp90與輔伴侶Hsp70的結(jié)合減少，進(jìn)一步提示Hsp90失去保護(hù)客戶蛋白的伴侶功能。

2.4FM-NOV17對Skbr3細(xì)胞熱休克蛋白的影響FM-NOV17對熱休克相關(guān)蛋白的影響的檢測結(jié)果表明，F(xiàn)M-NOV17 1 μmol/L處理細(xì)胞24 h，可引起Skbr3細(xì)胞中Hsp27和p60HOP蛋白減少，而Hsp70蛋白不變，這與經(jīng)典的Hsp90 N-末端抑制劑不同。如圖4所示，陽性對照藥GA可引起抗凋亡因子Hsp70明顯增加。

2.5FM-NOV17引起Skbr3細(xì)胞周期阻滯FM-NOV17處理細(xì)胞48 h，可顯著引起Skbr3細(xì)胞阻滯于S期和G2/M期，S期細(xì)胞百分比從48.55%增加到60.16%，G2/M期細(xì)胞百分比從13.26%增加到32.08%，提示FM-NOV17可能導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞有絲分裂障礙(圖5)。

2.6FM-NOV17誘導(dǎo)Skbr3細(xì)胞凋亡用含有Annxin V-FITC和PI的緩沖液避光孵育細(xì)胞15 min，用流式細(xì)胞儀檢測FM-NOV17誘導(dǎo)Skbr3細(xì)胞凋亡百分率。結(jié)果表明，F(xiàn)M-NOV17可以顯著誘導(dǎo)Skbr3細(xì)胞凋亡，早期凋亡細(xì)胞(Annexin V+/PI-)的百分率從3.7%增加至36.9%，晚期凋亡細(xì)胞(Annexin V+/PI+)的百分率從0.8%增加至11.4%(圖6)。

1.CTL；2.FM-NOV17 0.5 μmol/L；3.FM-NOV17 1 μmol/L; 4.GA 5 μmol/L.　　A：用Hsp90單抗免疫共沉淀與Hsp90結(jié)合的客戶蛋白及輔伴侶分子；B：用Her2單抗免疫共沉淀與Her2結(jié)合的Hsp90及其輔伴侶分子.　藥物處理Skbr3細(xì)胞6 h，結(jié)合使用免疫共沉淀和蛋白印跡法檢測Her2/Hsp90/Hsp70復(fù)合物形成情況.圖3　FM-NOV17對Her2/Hsp90和Hsp90/Hsp70結(jié)合的影響Fig 3　Effects of FM-NOV17 on chaperone complexes associated with Hsp90

1.CTL；2.FM-NOV17 1 μmol/L；3.GA 5 μmol/L.藥物處理Skbr3細(xì)胞24 h，使用蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞內(nèi)熱休克相關(guān)蛋白表達(dá)水平.圖4　FM-NOV17對Skbr3細(xì)胞熱休克相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig 4　Effects of FM-NOV17 on Hsps in Skbr3 cells

3討論

Hsp90經(jīng)典抑制劑GA由于較大的肝毒性及較差的水溶性等缺點(diǎn)，限制了其在臨床上的應(yīng)用。通過化學(xué)改造，把17位甲氧基用烯丙胺基取代后得到的衍生物17-烯丙胺-17-去甲氧基格爾德霉素(17-allyamino-17-demethoxygeldanamycin，17-AAG)，有更高的抗腫瘤活性和更低的肝毒性，是第一個進(jìn)入臨床試驗(yàn)的Hsp90抑制劑[11-13]。但是17-AAG的水溶性較差，生物利用度有限，對不同類型的腫瘤療效差異性較大。因此合成更加高效低毒且不易被腫瘤細(xì)胞耐藥的新型Hsp90抑制劑成為臨床的迫切需要?；诖?，本課題組以多種母體化合物為基礎(chǔ)，通過不同的合成路徑，合成并篩選了一系列的Hsp90抑制劑，期望能合成和篩選到成藥性較強(qiáng)的新型Hsp90抑制劑。

FM-NOV17處理細(xì)胞48 h，使Skbr3細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯于G2/M期.圖5　FM-NOV17對Skbr3細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程的影響Fig 5　Effects of FM-NOV17 on cell cycle in Skbr3 cells

FM-NOV17處理細(xì)胞48 h，呈劑量依賴性地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.圖6　FM-NOV17誘導(dǎo)Skbr3細(xì)胞凋亡Fig 6　Apoptosis induced by FM-NOV17 in Skbr3 cells

乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7%~10%。Her2又稱人表皮生長因子受體-2，Her2陽性乳腺癌是“最兇險的乳腺癌”，Her2基因擴(kuò)增是乳腺癌預(yù)后差的獨(dú)立評估因子。Her2可以激活PI3K-AKT-mTOR、Ras-Raf-MEK-ERK等多條信號傳導(dǎo)通路，刺激乳腺癌細(xì)胞增殖。因此Her2是乳腺癌治療的一個重要靶點(diǎn)。盡管Her2的單克隆抗體赫賽汀能一定程度延長患者的生存期，但其作用仍然有限，且有過敏反應(yīng)等不良反應(yīng)，而且臨床治療成本高昂。因此尋找成本低、療效好、毒性低、能抑制Her2激活的信號途徑的新化合物成為臨床需要。

在Skbr3細(xì)胞中，Her2蛋白與Hsp90和輔伴侶分子形成復(fù)合物，保護(hù)Her2蛋白具有傳遞增殖信號的活性，不容易被蛋白酶所水解。AKT信號通路是腫瘤細(xì)胞增殖的重要信號通路，Her2蛋白能夠激活該通路。本研究表明，基于NOV的新型化合物FM-NOV17可使Her2/Hsp90/Hsp70復(fù)合物減少，使得Her2失去伴侶分子保護(hù)，最終可能被蛋白酶體所降解，從而引起Her2蛋白水平降低。作為下游的信號通路AKT的活性也隨之被抑制，表現(xiàn)為AKT和p-AKT減少。

經(jīng)典的Hsp90抑制劑會誘導(dǎo)抗凋亡因子Hsp70的表達(dá)，提示腫瘤細(xì)胞可能對經(jīng)典的N-末端抑制劑容易產(chǎn)生耐藥性。為了研究FM-NOV17是否也會像N-末端抑制劑一樣誘導(dǎo)Hsp70、Hsp27和p60HOP等熱休克相關(guān)蛋白的表達(dá)，用免疫印跡法分析這些熱休克相關(guān)蛋白水平。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)M-NOV17和GA一樣都能使Her2和Hsp90結(jié)合減少，但是FM-NOV17使與Hsp70結(jié)合的Her2和Hsp90均減少，相反，GA使與Hsp70結(jié)合的Her2和Hsp90均增加。提示與經(jīng)典N-末端抑制劑相比，F(xiàn)M-NOV17不容易誘導(dǎo)耐藥因子Hsp70的表達(dá)，因此可能更不容易誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的化療耐藥性。而且FM-NOV17對Hsp90伴侶功能的影響發(fā)生在Her2蛋白減少之前，因此FM-NOV17很可能是通過抑制Hsp90伴侶功能來減少Her2蛋白，是一種新型的Hsp90抑制劑。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡，不是一個被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列信號級聯(lián)反應(yīng)。細(xì)胞凋亡的早期，膜磷脂酰絲氨酸由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，它通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V是檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)。凋亡晚期，細(xì)胞核通透性增加，PI可以進(jìn)入細(xì)胞核。本研究表明，與經(jīng)典N-末端抑制劑GA能夠抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、引起細(xì)胞周期阻滯作用相似[14]，F(xiàn)M-NOV17能干擾Her2+乳腺癌細(xì)胞Hsp90伴侶功能，促進(jìn)Her2蛋白降解，下調(diào)Her2激活的下游細(xì)胞信號通路，從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，最終抑制Her2高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞生長。

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(編輯：何佳鳳)

《福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》

雙月刊CN 35-1192/R郵發(fā)代號 34-66

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Effects of FM-NOV17 on Her2+Breast Cancer Cells And its Mechanisim

KE Chunlin1, LIN Shuai2, TIAN Jue2, KE Fang3, WU Lixian2

1. Department of Radiation Oncology, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China;2. Department of Pharmacology, Fuijan Key Laboratory of Natural Medicine Pharmacology,Fujian Medical University,Fuzhou 350108, China;3. Department of Pharmacochemistry, School of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350108, China

ABSTRACT:ObjectiveTo confirm the effects of FM-NOV17, one of novobiocin derivatives, on breast cancer cells (Skbr3), and to study the relationship between these effects and the molecular chaperone functions of heat shock protein 90 (Hsp90).MethodsThe quantity of Her2 protein was determined by Western-blot.Molecular chaperone functions of Hsp90 on breast cancer cells were measured by coimmunoprecipitation.After the co-immunoprecipitation of Her2 and its molecular chaperones, the immunoprecipitate was then subjected to Western-blot analysis with anti-Her2 to study changes in quantity of anti-Hsp90, or anti-Hsp70 mAb.ResultsAn exposure of Skbr3 cells to FM-NOV17 led to down-regulation of intracellular Her2 protein levels.FM-NOV17 treatment also decreased the binding of Her2 with Hsp90 and Hsp70.Consequently, apoptosis and cell cycle arrest were induced.ConclusionsThese studies demonstrate that the activities of FM-NOV17 might inhibit breast cancer cells through the disruption of Hsp90 chaperon function, which results in disruption of the binding of Her2 to Hsp90 and cochaperons and the level of Her2 protein.That may be an important mechanism, by which FM-NOV17 mediates its effects on breast cancer cells.

KEY WORDS:novobiocin; proteins; Hsp90 heat-shock proteins; heat-shock proteins; molecular chaperones; breast neoplasms/cytology

通訊作者:吳麗賢. Email: wlx-lisa@126.com

作者簡介:柯春林(1977-)，男，主治醫(yī)師

基金項目:國家自然科學(xué)基金(81273541)；福建省自然科學(xué)基金杰出青年項目(2011J06013)

收稿日期:2014-11-21

中圖分類號:R329.2；R329.25；R737.9；R977.6；R978.15

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1672-4194(2015)01-0001-06

作者單位: 福建醫(yī)科大學(xué) 1. 附屬第一醫(yī)院 放射治療科，福州350001；2. 藥學(xué)院 藥理系，福建省天然藥物藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州350108；3. 藥學(xué)院 藥化系，福州350108