辛伐他汀和阿托伐他汀對人結(jié)腸癌和肺癌細胞株作用的探究*

謝亞磊賀巾釗李瓊朱玲△(.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院0級基礎醫(yī)學國家基地班,四川成都 6004; .四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院藥理教研室,四川成都 6004)

辛伐他汀和阿托伐他汀對人結(jié)腸癌和肺癌細胞株作用的探究*

謝亞磊1賀巾釗1李瓊2朱玲2△
(1.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院2011級基礎醫(yī)學國家基地班,四川成都 610041; 2.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院藥理教研室,四川成都 610041)

摘要目的:初步探究他汀類藥物對人結(jié)腸癌和肺癌細胞株的毒性作用。方法:以四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法測定辛伐他汀(Simvastatin,SV)和阿托伐他汀(Atorvastatin,AV)對結(jié)腸癌細胞株HCT116、肺癌細胞株A549的細胞毒作用,計算兩種藥物對不同腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)。結(jié)果:SV、AV對HCT116的IC50分別為42.992μmol·L-1、47.845μmol·L-1,SV、AV對A549的IC50分別為41.50μmol·L-1、50.06μmol·L-1。結(jié)論:SV、AV對兩種腫瘤細胞均有抑制作用,抑制率大小呈劑量依賴性,不同他汀類藥物對腫瘤細胞的抑制作用存在差異。

關鍵詞:辛伐他汀;阿托伐他汀;結(jié)腸癌細胞;肺癌細胞;半數(shù)抑制濃度

他汀類藥物是膽固醇生物合成中甲羥戊酸合成所需羥甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A, HMG-Co A)還原酶的抑制劑,廣泛用于降脂治療,對于心血管疾病的治療具有重要意義[1]。近些年來他汀類藥物的其他多種細胞生物效應,尤其是抗腫瘤作用,逐漸受到重視。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種他汀類藥物,可以通過抑制類異戊二烯中間體的合成,來抑制蛋白的翻譯后修飾,通過誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖和抗血管生成發(fā)揮抗腫瘤作用[2-4],且他汀類藥物還能增加癌細胞對化療藥物的敏感性。

目前辛伐他汀(Simvastatin,SV)和阿托伐他汀(Atorvastatin,AV)是他汀類藥物抗腫瘤作用相關研究的典型代表。兩者均為脂溶性他汀類藥物,但兩者的分子結(jié)構(gòu)不同,已有研究發(fā)現(xiàn)SV和AV在發(fā)揮調(diào)脂和抗腫瘤作用中的等效劑量、生物利用度、蛋白結(jié)合和消除、遺傳藥理學因素和細胞作用等均存在差異。相同劑量的AV和SV對心血管的作用可以是相反的[5]。大量的臨床試驗和動物模型也證實,辛伐他汀和阿托伐他汀對結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌等多種腫瘤的生長均有抑制作用[6-8]。通過以細胞為基礎的基因芯片和生物信息學分析也為他汀類藥物的抗腫瘤作用提供支持依據(jù)[9]。肺癌和結(jié)腸癌是嚴重威脅全球人類健康的惡性腫瘤疾病,尤其是發(fā)展中國家,有研究報道2023年肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等的發(fā)病率在這些國家將增長60%[10]。目前肺癌和結(jié)腸癌的化療方案得到廣泛應用,使得癌癥患者的壽命有所延長,新的抗腫瘤藥物研究也成為社會關注的一大熱點。已有研究發(fā)現(xiàn),在體外實驗中,不同濃度的洛伐他汀對卵巢癌、神經(jīng)母細胞瘤、宮頸癌細胞的抑制作用存在差異[11]。辛伐他汀對于肺癌細胞、結(jié)腸癌細胞抑制作用具有劑量依賴性[12,13],但尚未深入研究其最適抑制濃度及測定其半數(shù)抑制濃度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)。

根據(jù)已有研究,本實驗通過四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法測定AV、SV對人結(jié)腸癌細胞株HCT-116、人肺癌細胞株A549的增殖抑制率和IC50,從而比較不同他汀類藥物的不同濃度對不同腫瘤細胞的細胞毒作用,同時為今后有關他汀類藥物對人腫瘤細胞的作用機制的研究奠定基礎,為臨床用藥和化療提供指導依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

HCT116細胞株為人結(jié)腸癌上皮來源細胞,A549細胞株為人肺腺癌來源細胞,均由原華西醫(yī)科大學感染免疫研究室提供,所用培養(yǎng)液為DMEM高糖細胞培養(yǎng)液(成都哈里生物工程有限公司),內(nèi)含12%小牛血清(成都哈里生物工程有限公司) 及100μg·ml-1青霉素、100μg·ml-1鏈霉素,于37℃, 5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng),每2天換液傳代一次。二甲基亞砜(DMSO)購自成都寶信實驗儀器經(jīng)營部。SV、AV為純品(大連美侖生物技術有限公司)純度>99%,用DMSO溶解稀釋成10μmol·ml-1,過濾除菌,-20℃避光凍存。四甲基偶氮唑藍(MTT)購自成都寶信實驗儀器經(jīng)營部,用PBS緩沖液溶解稀釋至5 mg·ml-1,過濾除菌,-20℃避光凍存?？焖偃鸺先疽?規(guī)格:30 ml)購自南京建成科技有限公司。

1.2 儀器

RDS2-302-125型液氮罐(成都液氮容器公司),0406-1型離心機(上海醫(yī)療器械有限公司手術器械廠),SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司),MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋電機),TS-1型脫色搖床(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司),Bio-Rad i Mark美國酶標儀(上海滕柔儀器設備有限公司),CHK-213倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.3 細胞復蘇與培養(yǎng)

將HCT116細胞株、A549細胞株從液氮中取出,37℃水浴解凍1~2 min,分別加入2 ml含12%小牛血清、100 U·m L-1青霉素和100 U·m L-1鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液, 1200 r·min-1離心3 min,棄上清,用相同培養(yǎng)液使細胞重懸,分裝于培養(yǎng)瓶(5 ml培養(yǎng)液),在5%CO2、37℃飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2天換液傳代一次。

1.4 細胞形態(tài)觀察

當細胞(對數(shù)生長期)融合達80%時,0.25%胰蛋白酶消化,并計數(shù)。用DMEM高糖培養(yǎng)液懸浮調(diào)整細胞密度至2.5×104·ml-1,接種于6孔板中,每孔加入2 ml細胞懸液。待接種完畢后,將6孔板放入5%CO2、37℃飽和濕度細胞培養(yǎng)箱過夜。待板中細胞貼壁后,小心吸棄孔中培養(yǎng)液,進行加藥處理。設置陰性對照組(3個復孔),每孔分別加2 ml DMEM高糖培養(yǎng)液。SV、AV組藥物濃度均為15、25、50μmol·L-1。每孔分別加藥2 ml。加藥完畢后,放入5%CO2、37℃飽和濕度細胞培養(yǎng)箱并計時。加藥處理完成后24 h后,使用快速瑞氏-姬姆薩染液進行染色后,在倒置鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.5 MTT法測定藥物對細胞的抑制率

取對數(shù)生長期細胞,用胰蛋白酶消化后并計數(shù)。調(diào)整細胞密度至2×104·ml-1,接種于96孔培養(yǎng)板,并設置空白對照組(調(diào)零孔)。待接種完畢后,將96孔板放入5%CO2、37℃飽和濕度細胞培養(yǎng)箱過夜。待板中細胞貼壁后,小心吸棄孔中培養(yǎng)液,進行加藥處理。設置陰性對照組,HCT116細胞實驗的SV組藥物濃度為15、25、30、50、60μmol·L-1;HCT116細胞實驗的AV組藥物濃度為12.5、25、50、75、100μmol·L-1。A549細胞實驗的AV、SV組藥物濃度為6.25、12.5、25、50、100μmol·L-1。每個濃度設置5個復孔。加藥完畢后,放入5%CO2、37℃飽和濕度細胞培養(yǎng)箱并計時。加藥處理完成后44 h,取出96孔板,向陰性對照組、SV和AV組分別加入5 mg·ml-1MTT溶液,每孔10μl,空白對照組不做處理,放入細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。4 h后,取出培養(yǎng)板,小心吸棄各孔中液體,每孔加入100μlDMSO溶液,振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解,用酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm波長測各孔吸光值(OD值)并記錄。上述操作需小心避光。

1.6 統(tǒng)計分析

按照下列公式計算各實驗組抑制率:抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。重復上述實驗操作3次,獲取平均抑制率,并計算出標準差。計數(shù)資料以±SD表示,采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學分析,獲取IC50值[14]。采用Graphpad 5.0對不同組別進行單因素方差分析,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)觀察

阿托伐他汀和辛伐他汀均具有明顯的細胞抑制作用。在倒置鏡下觀察細胞形態(tài),陰性對照組細胞貼壁生長,形態(tài)數(shù)量正常。加藥組細胞大小明顯較對照組小,同一視野下,加藥組細胞細胞數(shù)量減少,且高濃度組細胞抑制作用明顯高于中、低濃度,如圖1所示。

2.2 MTT法測定藥物對細胞的抑制率

MTT法檢測并計算所得不同濃度SV、AV對HCT116、A549細胞抑制率大小,如表1所示。在一定范圍內(nèi),隨著藥物濃度的增加,藥物對細胞的抑制率明顯增加(P<0.01)。中低濃度的AV對人結(jié)腸癌HCT116細胞、人肺癌A549細胞的抑制作用高于同濃度SV的腫瘤抑制作用(P<0.01)。同一種他汀類藥物對于不同腫瘤的抑制作用差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。不同濃度SV對HCT116細胞抑制率如圖2A所示,IC50值為42.992μmol·L-1。不同濃度AV對HCT116細胞抑制率如圖2B所示,IC50值為47.845μmol·L-1。不同濃度SV對A549細胞抑制率如圖2C所示,IC50值為41.5μmol·L-1。不同濃度AV對A549細胞抑制率如圖2D所示,IC50值為50.06μmol·L-1。

圖1　AV、SV對HCT116細胞、A549細胞形態(tài)的影響(×40)A-D為不同濃度阿托伐他汀作用于HCT116細胞;E-H為不同濃度阿托伐他汀作用于A549細胞;I-L為不同濃度辛伐他汀作用于HCT116細胞;M-P為不同濃度辛伐他汀作用于A549細胞。

表1　不同濃度SV、AV對HCT116、A549的抑制率(±SD,n=18)

表1　不同濃度SV、AV對HCT116、A549的抑制率(±SD,n=18)

抑制率(100%)劑量(μmol·L-1) 6.25　12.5　15　25　30　50　60　75　100 SV-HCT116　-　-　31.5±2.4　 40.4±1.1　 50.1±2.5　 59.5±1.8　 66.8±1.0　-　-AV-HCT116　-　24.7±0.3　-　42.3±1.1　-　49.8±0.4　-　65.3±1.6 71.3±0.7 SV-A549　15.5±9.9　 18.3±9.4　-　32.3±5.8　-　44.3±7.3　-　-　79.0±3.5 AV-A549　21.5±1.7　 33.6±1.1　-　42.9±0.5　-　51.4±1.1　-　-　70.5±0.7

圖2　不同濃度他汀類藥物對腫瘤細胞的增殖抑制

3 討論

結(jié)直腸癌、肺癌是全球常見癌癥疾病,嚴重威脅人類健康生存,一直以來都是全球關注的焦點[15]。早期的惡性腫瘤的治療以手術治療為主,常伴有術后放化療,化療藥物主要有氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他濱、替加氟/尿嘧啶、奧沙利鉑、依立替康等[16]。除此之外,腫瘤的治療方式還有分子靶向治療,如西妥昔單抗和貝伐單抗。近年來,他汀類藥物抑制腫瘤生長的作用得到廣泛認可,有流行病學調(diào)查顯示長期服用他汀類藥物組患結(jié)腸癌的風險要比不服用他汀類藥物組低47%[17]。目前有關他汀類藥物對腫瘤作用機制的研究多集中在細胞水平,其可通過干擾多條信號通路,影響細胞周期來發(fā)揮抗腫瘤作用,同時他汀類藥物對正常細胞的影響較小,因而是一個十分具有前景的抗腫瘤藥物。

本實驗采用的MTT用于檢測藥物作用于細胞的抑制率具有方便快捷、簡單易行、無放射性等特性,使得其不僅廣泛用于腫瘤細胞機制相關研究也廣泛用于臨床,通過癌細胞藥敏實驗對腫瘤化療有重要指導意義。

本實驗以MTT法測定不同濃度的SV、AV對HCT116、A549的細胞毒作用,驗證了他汀類藥物對細胞增殖確實有抑制效應,結(jié)合已有的文獻報道,通過比較不同他汀類藥物對不同腫瘤細胞增殖抑制效應的不同點,說明SV與AV對腫瘤的抑制作用存在差異。本實驗通過測定不同他汀類藥物對不同腫瘤細胞的IC50,不僅為后期開展他汀類藥物對腫瘤細胞作用機制的相關研究提供理論基礎和實驗依據(jù),而且對新的抗不同腫瘤藥物的開發(fā),臨床應用劑量等具有指導意義,同時也為今后他汀類藥物在不同腫瘤的臨床應用提供依據(jù)。

參考文獻

1 Wierzbicki AS,Poston R,Ferro A.The lipid and non-lipid effects of statins[J].Pharmacol Ther,2003,99(1):95-112.

2 Spampanato C,De Maria S,Sarnataro M,et al.Simvastatin inhibits cancer cell growth by inducing apoptosis correlated to activation of Bax and down-regulation of BCL-2 gene expression[J].Int J Oncol, 2012,40(4):935-941.

3 Yang YC,Huang WF,Chuan LM,et al.In vitro and in vivo study of cell growth inhibition of simvastatin on chronic myelogenous leukemia cells[J].Chemotherapy,2008,54(6):438-446.

4 Gauthaman K,Fong CY,Bongso A.Statins,stem cells,and cancer [J].J Cell Biochem,2009,106(6):975-983.

5 Zhou Z,Rahme E,Pilote L.Are statins created equal Evidence from randomized trials of pravastatin,simvastatin,and atorvastatin for cardiovascular disease prevention[J].Am Heart J,2006,151(2): 273-281.

6 Yang Z,Xiao H,Jin H,et al.Synergistic actions of atorvastatin withγ‐tocotrienol and celecoxib against human colon cancer HT29 and HCT116 cells[J].Int J Cancer,2010,126(4):852-863.

7 Mistafa O,Stenius U.Statins inhibit Akt/PKB signaling via P2X7 receptor in pancreatic cancer cells[J].Biochem Pharmacol,2009,78 (9):1115-1126.

8 Demierre MF,Higgins PDR,Gruber SB,et al.Statins and cancer prevention[J].Nat Rev Cancer,2005,5(12):930-942.

9 Gao Y,Lu XC,Yang HY,et al.The molecular mechanism of the anticancer effect of atorvastatin:DNA microarray and bioinformatic analyses[J].Int J Mol Med,2012,30(4):765-774.

10 Ferlay J,Shin HR,Bray F.Cancer incidence and mortality worldwide[DB/OL]http://globocan.iarc.fr,2010.

11 Liu H,Liang SL,Kumar S,et al.Statins induce apoptosis in ovarian cancer cells through activation of JNK and enhancement of Bim expression[J].Cancer Chemother Pharmacol,2009,63(6):997-1005.

12 Yu X,Pan Y,Ma H,et al.Simvastatin inhibits proliferation and induces apoptosis in human lung cancer cells[J].Oncol Res,2013,20 (8):351-357.

13 Cho SJ,Kim JS,Kim JM,et al.Simvastatin induces apoptosis in human colon cancer cells and in tumor xenografts,and attenuates colitis-associated colon cancer in mice[J].Int J Cancer,2008,123 (4):951-957.

14 趙斌,葛金芳,朱娟娟,等.小議在MTT法測細胞增殖抑制率中IC50的計算方法[J].安徽醫(yī)藥,2007,11(9):834-836.

15 Siegel R,Ma J,Zou Z,et al.Cancer statistics,2014[J].CA Cancer J Clin,2014,64(1):9-29.

16 Mano MS,Duhoux F.Colon cancer:update on adjuvant therapy[J]. CLIN COLORECTAL CANC,2008,7(3):178-183.

17 Poynter JN,Gruber SB,Higgins PDR,et al.Statins and the risk of colorectal cancer[J].N Engl J Med,2005,352(21):2184-2192.

Study on the effects of atorvastatin and simvastatin on human colon cancer and lung cancer cells*

Xie Ya-Lei1,He Jin-Zhao1,Li Qiong2,Zhu Ling2△
(1.Basic Medical Base Class 2011,Preclinical and Forensic Medicine,Sichuan University,Sichuan Chengdu 610041; 2.Department of Pharmacology,Preclinical and Forensic Medicine,Sichuan University,Sichuan Chengdu 610041)

Abstract Objective:To measure the cytotoxic effects of the statins on human cancer cells.Methods:The cytotoxic effects of the statins on human colon cancer cells HCT116 and lung cancer cells A549 were measured by MTT to determine IC50values of atorvastatin and simvastatin on HCT116 and A549.Results:IC50values of atorvastatin on HCT116 is 42.992μmol·L-1,IC50values of simvastatin on HCT116 is 47.845μmol·L-1·IC50values of simvastatin on A549 is 41.5μmol·L-1,IC50values of atorvastatin on A549 is 50.06μmol·L-1.Conclusion:SV and AV could inhibit the proliferation of cancer cells.Statins inhibit cancer cells in a dosedependent manner,different statins have different effects on cancer cells.

Key Words:Simvastatin;Atorvastatin;Colon cancer cells;Lung cancer cells;IC50values

(收稿日期：2015-8-24)

通訊作者:△朱玲,女,教授,主要從事化療藥理學、時間藥理學研究, Email:zhuling529@163.com。

作者簡介:謝亞磊,男,四川大學2011級基礎醫(yī)學本科生,Email:ange10070420@163.com。

*基金項目:國家基礎科學人才培養(yǎng)基金能力提高項目資助(編號: J1103604)