梅花鹿鹿茸組織Anxa-1基因cDNA克隆及表達(dá)1)

曲昊淼 丁玲 趙姬臣 夏彥玲

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

梅花鹿鹿茸組織Anxa-1基因cDNA克隆及表達(dá)1)

曲昊淼 丁玲 趙姬臣 夏彥玲

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

從梅花鹿(Cervusnippon)鹿茸間充質(zhì)中成功克隆出包括膜聯(lián)蛋白A1(Anxa-1)基因全部編碼區(qū)的cDNA序列，并結(jié)合生物學(xué)信息方法及實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)該基因的氨基酸序列及不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：Anxa-1基因編碼346個(gè)氨基酸。經(jīng)生物學(xué)信息分析，該基因編碼蛋白為穩(wěn)定蛋白，不具備信號(hào)肽，相對(duì)分子質(zhì)量為38 830.4，理論等電點(diǎn)為6.17，一級(jí)結(jié)構(gòu)中亮氨酸占最大比例(10.4%)。同源序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，梅花鹿Anxa-1氨基酸序列與藏羚羊(Pantholopshodgsonii)、綿羊(Ovisaries)、山羊(Caprahircus)和水牛(Bubalusbubalis)相似性較高。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析表明，Anxa-1基因在不同生長(zhǎng)時(shí)期鹿茸頂端間充質(zhì)表達(dá)存在差異，生長(zhǎng)前期的表達(dá)量高于中期與后期。

膜聯(lián)蛋白A1；鹿茸；cDNA；克??；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

We cloned the cDNA sequence including all the coding region of theAnxa-1 gene from sika deer antler mesenchymal for the first time, and used bioinformatics method and real-time RT-PCR to analyze the amino acid sequence and the expression at different phases. TheAnxa-1 gene encoded a peptide of 346 amino acid residues of which the relative molecular weight was 38 830.4. By analyzing biological information, the gene had an isoelectric point of 6.17, and did not contain a signal peptide; Leucine accounted for the largest proportion in the primary structure was 10.4%. Homologous sequence alignment and phylogenetic tree analysis indicated that theAnxa-1 mature protein of sika deer was highly similarity withPantholopshodgsonii,Ovisaries,CaprahircusandBubalusbubalis. By real-time RT-PCR, the gene expression at different phases had specificity, and the expression of theAnxa-1 gene was higher at its earlier stage than that at its intermediate and advanced stage.

鹿茸為雄鹿(馴鹿除外)未骨化而帶有茸毛的幼角，是我國(guó)一種傳統(tǒng)貴重的滋補(bǔ)藥材，在中醫(yī)臨床中占有重要地位，已有兩千多年的入藥歷史。鹿茸的獨(dú)特之處在于其是所有動(dòng)物組織中唯一可以循環(huán)再生的組織；在生長(zhǎng)旺期，其尖端組織細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)速度是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度的30多倍，但沒(méi)有任何癌變跡象，這吸引了眾多科學(xué)家的高度關(guān)注[1-3]，是研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)與分化的理想材料。鹿茸的快速增長(zhǎng)離不開(kāi)各種基因的調(diào)控，而這些基因由于其自身因素及其在不同生長(zhǎng)階段表達(dá)量的不同，導(dǎo)致其在組織中存在不同的調(diào)控作用，因此了解基因在鹿茸組織中的調(diào)控作用有助于更深層次的了解鹿茸的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理。

膜聯(lián)蛋白A1(Anxa-1)是一種以Ca2+介導(dǎo)能與帶有負(fù)電荷的細(xì)胞膜磷脂相結(jié)合的蛋白，是Annexin超家族在脊椎動(dòng)物中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)且研究最為深入的成員。Anxa-1廣泛分布于動(dòng)植物的各種組織器官中，不同動(dòng)植物中其氨基酸殘基組成的長(zhǎng)度也有很大不同[4]，最早是作為糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的磷脂酶A2抑制蛋白被發(fā)現(xiàn)的。Anxa-1在細(xì)胞分化、增殖及凋亡過(guò)程中起著重要作用[5]，研究表明，其在不同類型的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量存在顯著差異。目前GenBank中尚無(wú)鹿源Anxa-1基因序列的任何記錄。本研究根據(jù)牛、豬等物種Anxa-1基因序列設(shè)計(jì)同源引物，首次成功克隆了具有完整編碼區(qū)的Anxa-1基因的cDNA序列，并對(duì)其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)研究了鹿茸間充質(zhì)在不同生長(zhǎng)時(shí)期——生長(zhǎng)前期(小鞍子)、生長(zhǎng)中期(二杠茸)、生長(zhǎng)后期(三杈茸)中Anxa-1基因的表達(dá)差異，推測(cè)其在鹿茸生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用，這一研究的開(kāi)展可能為鹿茸的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理的研究提供很好的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取人工馴養(yǎng)的一頭健康成年?yáng)|北梅花鹿(Cervusnippon)作為試驗(yàn)動(dòng)物。在其小鞍子茸型時(shí)采集左茸頂端組織作為前期試驗(yàn)樣品，在其二杠茸型時(shí)采集右茸頂端組織作為中期試驗(yàn)樣品，在其被鋸的左茸再長(zhǎng)至三杈茸型時(shí)采集其頂端組織作為后期試驗(yàn)樣品，分別截取3個(gè)時(shí)期的鹿茸頂端5 cm左右，迅速將其表面消毒，縱向剖開(kāi)，按照Li等[6]所述的方法采取鹿茸頂端的間充質(zhì)組織，按每管大約100 mg分裝于凍存管中，迅速放入液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 鹿茸頂端間充質(zhì)組織的總RNA的提取及cDNA模板的獲取

按照TRIzol試劑的操作步驟分別提取鹿茸3個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期的總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光法檢測(cè)總RNA質(zhì)量(圖1)。以提取的總RNA為模板，以O(shè)ligo-dT為引物，以M-MLVⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

圖1 鹿茸頂端間充質(zhì)組織總RNA純度檢測(cè)

1.3 Anxa-1基因cDNA克隆

參照GenBank中牛、豬、綿羊等物種的Anxa-1基因序列，設(shè)計(jì)同源引物(Forward primer：CAAAAATGGCAATGGTAT和Reverse primer：ATCAAAGGAATGTTTAGTCTC)，以中期組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，涂板并于37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)6～8 h，經(jīng)陽(yáng)性克隆檢測(cè)送往華大公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4 Anxa-1的生物信息學(xué)分析

采用ORF程序查找序列的開(kāi)放閱讀框，用ExPASy服務(wù)器上ProtParam程序分析蛋白的理化性質(zhì)，ProScal程序分析蛋白的疏水性，使用NCBI上的BlastP程序進(jìn)行蛋白保守區(qū)預(yù)測(cè)，應(yīng)用軟件SignalP3.0預(yù)測(cè)蛋白的信號(hào)肽，使用PSORT Ⅱ和TMHMM Server v.2.0對(duì)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位及跨膜蛋白分析，使用SOPMA軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。利用軟件DNAStar和MEGA5.0進(jìn)行氨基酸的多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的繪制。

1.5 Anxa-1的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析

分別提取鹿茸尖端不同生長(zhǎng)時(shí)期的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。合成Anxa-1基因的特異性引物(Forward primer：GCTATCCCCATCTCCGCAG和Reverse primer：GGCTGGCTTGTAGCACACTTC)，以β-actin作為內(nèi)參基因(Forward primer：GCGTGACATCAAGGAGAAGC和Reverse primer：GGAAGGACGGCTGGAAGA)，對(duì)鹿茸不同生長(zhǎng)時(shí)期的Anxa-1基因表達(dá)量進(jìn)行定量分析。在ABI公司的7500 Real-Time PCR system上進(jìn)行Real-time RT-PCR，PCR反應(yīng)體系(25.0 μL)包括：SYBR Premix EXTaqTM Ⅱ(2×)12.5 μL，正向及反向引物(10 mmol·L-1)各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，加高壓滅菌水補(bǔ)足體積至25.0 μL。反應(yīng)程序分為兩部分：第一部分為擴(kuò)增反應(yīng)，95 ℃ 10 min，在95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s下循環(huán)40次，設(shè)定在每個(gè)循環(huán)中60 ℃ 1 min時(shí)讀取熒光值；第二部分為建立熒光PCR產(chǎn)物熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72 ℃升溫至95 ℃，持續(xù)15 s，然后降至60 ℃，持續(xù)1 min，之后緩慢升溫至95 ℃，整體反應(yīng)結(jié)束。使用軟件ABI 7500 Software Version 2.3分析Anxa-1基因相對(duì)β-actin基因的的差異表達(dá)Ct值，通過(guò)普遍使用的2-ΔΔCt法[7]來(lái)計(jì)算分析基因在不同時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量，其中，ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)標(biāo)基因)；ΔΔCt=ΔCt(試驗(yàn)組)-ΔCt(對(duì)照組)；2-ΔΔCt表示試驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組變化的倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Anxa-1基因cDNA的獲得

Anxa-1基因的陽(yáng)性克隆檢測(cè)獲得一條1 000 bp左右的插入片段(圖2)，后經(jīng)測(cè)序公司反饋回的雙向測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAStar拼接得到1 059 bp片段，與預(yù)期片段大小一致。經(jīng)進(jìn)一步與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)分析，證實(shí)為Anxa-1基因的cDNA序列(圖3)。

M.DL2000 Marker；1.陽(yáng)性菌落PCR產(chǎn)物。

圖3 Anxa-1基因的cDNA序列和推定的氨基酸序列

2.2 Anxa-1基因的序列

ORF程序顯示：Anxa-1基因的開(kāi)放閱讀框?yàn)? 041 bp，編碼346個(gè)氨基酸；通過(guò)NCBI的BlastP在蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Anxa-1基因進(jìn)行蛋白保守區(qū)預(yù)測(cè)表明，與此基因匹配的蛋白保守區(qū)共有4個(gè)Annexin結(jié)構(gòu)域，其匹配區(qū)段分別為從第47～111個(gè)氨基酸、第118～183個(gè)氨基酸、第202～267個(gè)氨基酸和第277～342個(gè)氨基酸(圖4)；ProtParam軟件預(yù)測(cè)Anxa-1基因編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為38 830.4，理論等電點(diǎn)為6.17，整個(gè)氨基酸組成中亮氨酸占最大比例(10.4%)，其次為賴氨酸(9.8%)，不穩(wěn)定系數(shù)為39.26，屬于穩(wěn)定蛋白；使用SignalP3.0軟件顯示該基因編碼的蛋白質(zhì)不具備信號(hào)肽；利用TMHMM Server v.2.0軟件預(yù)測(cè)到其跨膜蛋白的數(shù)目為0，結(jié)果預(yù)期數(shù)值為0.00019，分值小于18，它不可能是一個(gè)跨膜蛋白；使用PSORT Ⅱ軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析表明，56.5%的可能性在細(xì)胞質(zhì)中。

圖4 推導(dǎo)的Anxa-1氨基酸保守區(qū)查找結(jié)果

2.3 不同物種間Anxa-1的同源性

將梅花鹿與GenBank選出的8種動(dòng)物的Anxa-1氨基酸全序列進(jìn)行BlastP對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其與藏羚羊(Pantholopshodgsonii)、綿羊(Ovisaries)、山羊(Caprahircus)、水牛(Bubalusbubalis)具有很高的相似性，與小鼠(Musmusculus)和豬(Susscrofa)次之，而與原雞(Gallusgallus)和人(Homosapiens)的Anxa-1序列相似性最低。

應(yīng)用軟件DNAStar和MEGA5.0對(duì)9個(gè)物種的Anxa-1氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的繪制(圖5、圖6)，結(jié)果表明，不同物種的Anxa-1氨基酸表現(xiàn)出較高的同源性，說(shuō)明Anxa-1基因作為功能基因在進(jìn)化中具有較高的保守性。從進(jìn)化樹(shù)可以看出，在該基因座位上梅花鹿與藏羚羊、綿羊、山羊和水牛在進(jìn)化關(guān)系上較近，與原雞和人親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，分析結(jié)果與各種物種在傳統(tǒng)分類學(xué)上的地位一致。

1.梅花鹿(Cervusnippon)；2.綿羊(Ovisaries)；3.藏羚羊(Pantholopshodgsonii)；4.山羊(Caprahircus)；5.人類(Homosapiens)；6.豬(Susscrofa)；7.小鼠(Musmusculus)；8.水牛(Bubalusbubalis)；9.原雞(Gallusgallus)。

圖5 梅花鹿與其他動(dòng)物Anxa-1氨基酸的多重序列對(duì)比

圖6 動(dòng)物Anxa-1系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 Anxa-1基因的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的結(jié)果顯示，Anxa-1基因在鹿茸生長(zhǎng)前期表達(dá)量是中期的(1.84±0.34)倍，后期的表達(dá)量是中期的(1.12±0.26)倍，可見(jiàn)Anxa-1基因在鹿茸尖端表達(dá)的規(guī)律是前期>后期>中期(表1)。

表1 鹿茸頂端間充質(zhì)組織前期、后期與中期Anxa-1基因表達(dá)的差異

生長(zhǎng)期Anxa-1平均Ct值β-actin平均Ct值ΔCtΔΔCt2-ΔΔCt前期22.34±0.0323.04±0.19-(0.70±0.11)-(0.88±0.21)1.84±0.34中期(對(duì)照組)23.41±0.0323.23±0.110.18±0.0601.00后期22.68±0.2222.67±0.100.02±0.14-(0.16±0.24)1.12±0.26

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

3 結(jié)論與討論

Anxa-1基因cDNA中開(kāi)放閱讀框1 041 bp編碼346個(gè)氨基酸殘基，組成分子量為38 830.4的Anxa-1蛋白，其中心結(jié)構(gòu)域由4個(gè)重復(fù)序列組成，每個(gè)重復(fù)序列含有5個(gè)α螺旋。4個(gè)重復(fù)序列緊密壓縮在一起，形成一個(gè)輕度彎曲的盤狀結(jié)構(gòu)，具有與鈣離子及磷脂結(jié)合的位點(diǎn)。從其生物學(xué)信息分析中可以看出，其編碼蛋白質(zhì)沒(méi)有具備信號(hào)肽的可能，且不是跨膜蛋白，是高度保守的穩(wěn)定蛋白。利用MEGA軟件進(jìn)行物種間遺傳距離計(jì)算得出與原雞的遺傳距離最遠(yuǎn)，與藏羚羊遺傳距離最近，其分析結(jié)果與物種的傳統(tǒng)分類學(xué)地位十分一致，且符合進(jìn)化關(guān)系。

近年來(lái)的研究表明，Anxa-1基因可能是作為一種腫瘤抑制基因或某些腫瘤細(xì)胞/組織特定類型的腫瘤啟動(dòng)子。Srisomsap等[8]研究證明Anxa-1主要具有抑癌功能，其在腫瘤形成前呈高表達(dá)，其后隨不同程度而減弱。也有研究表明其可抑制由表皮生長(zhǎng)因子(EGF)引起的肝細(xì)胞增殖[9]。但有研究發(fā)現(xiàn)Anxa-1也可促進(jìn)細(xì)胞增殖，在肝細(xì)胞中磷酸化的Anxa-1可作為一種誘導(dǎo)信號(hào)刺激細(xì)胞信使前列腺素E2的釋放，從而引發(fā)一系列的細(xì)胞增殖反應(yīng)[10]。目前就Anxa-1基因在細(xì)胞增殖中的作用還存在疑議，有可能是其在不同的組織細(xì)胞中發(fā)揮不一樣的作用導(dǎo)致。本研究發(fā)現(xiàn)，Anxa-1基因在鹿茸生長(zhǎng)前期表達(dá)量高于生長(zhǎng)中期、后期的表達(dá)量，由此可以推測(cè)其在生長(zhǎng)前期抑制了鹿茸細(xì)胞的增殖，而到了中期和后期表達(dá)下調(diào)，鹿茸得以進(jìn)入快速增長(zhǎng)期。

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Cloning and Expression Analysis ofAnxa-1 Gene cDNA from Sika Deer Antler Tissue

Qu Haomiao, Ding Ling, Zhao Jichen, Xia Yanling(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)/Journal of Northeast Forestry University，2015,43(3)：99-103.

Annexin A1; Antler; cDNA; Clone; Real-time RT-PCR

曲昊淼，男，1988年10月生，東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，碩士研究生。E-mail：510008084@qq.com。

夏彥玲，東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，副教授。E-mail：xiayanling1974@163.com。

2014年8月4日。

S825.2

1)中國(guó)博士后基金(20110491124)。

責(zé)任編輯：程 紅。