不同生長階段白鮮皮中黃柏酮和梣酮累積量的變化規(guī)律1)

劉麗娟 張國鴻

(通化師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，吉林省通化市，134002) (九臺市土肥站)

孫文藝 南敏倫 趙昱瑋 赫玉芳

(吉林大學(xué)) (吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院)

不同生長階段白鮮皮中黃柏酮和梣酮累積量的變化規(guī)律1)

劉麗娟 張國鴻

(通化師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，吉林省通化市，134002) (九臺市土肥站)

孫文藝 南敏倫 趙昱瑋 赫玉芳

(吉林大學(xué)) (吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院)

連續(xù)2 a采集白鮮皮樣品，采用加熱回流法提取白鮮皮中的黃柏酮和梣酮，通過高效液相色譜法測定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明：白鮮皮中黃柏酮和梣酮累積量，均與生長年限呈正相關(guān)，同一種成分的年變化基本相同。黃柏酮與梣酮的年變化規(guī)律差異較大，2種成分在一個生育期的不同生長階段，積累量差異顯著；果期的黃柏酮和花期的梣酮累積量最大。白鮮春季或秋季采收均可，3年生以上的適宜采收。

白鮮皮；高效液相色譜法；黃柏酮；梣酮

白鮮(DictamnusdasycarpusTurcz.)又稱八股牛，蕓香科白鮮屬，多年生草本植物，全株有強烈的香氣。根皮入藥稱為白鮮皮，是一種常用中藥，為歷代本草及中國藥典收載。味苦，性寒，具有解毒、祛熱、利尿、除濕和殺蟲等功效，能治皮膚瘙癢、濕疹、黃水瘡、黃疸、肝炎和陰部瘙癢等疾病。白鮮葉可提取芳香油；根莖作農(nóng)藥，可防治多種病蟲害[1-2]。近年來，國內(nèi)外研究表明，白鮮皮中含有白鮮堿、梣酮、茵芋堿、γ-崖椒堿、黃柏酮等成分[3]，其中的梣酮和白鮮堿具有殺菌活性[4]，復(fù)方乳膏用于治療急性濕疹、慢性濕疹、蕁麻疹[5]。

白鮮皮屬于東北道地藥材，主產(chǎn)于東北三省和內(nèi)蒙古，其產(chǎn)量占到全國總量的80%左右；因完全依賴野生品供應(yīng)，隨著資源量逐年的減少，價格呈逐年上漲趨勢。無度采挖，生存環(huán)境逐年破壞，導(dǎo)致產(chǎn)量急劇下降；人工栽培已在部分地區(qū)開始。2010版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，黃柏酮和梣酮為白鮮質(zhì)量控制指標(biāo)成分[6]。為規(guī)范栽培，連續(xù)2 a定期取樣，進(jìn)行了不同生長發(fā)育時期白鮮皮中黃柏酮和梣酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定，旨在為合理施肥、提供優(yōu)質(zhì)原料、最佳采收期的確定提供參考。

1 材料與方法

儀器：日立L-2000型高效液相色譜儀。色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以V(甲醇)∶V(水)=60∶40為流動相；檢測波長236 nm；流速1 mL/min；柱溫為室溫。理論板數(shù)以梣酮峰計算應(yīng)不低于3 000。

試藥：黃柏酮和梣酮對照品批號，分別為111923-201102、111700-201002，對照品購于中國藥品生物制品檢定所。甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑皆為分析純。

樣品：試驗材料采集于吉林省通化縣窟窿楊樹白鮮人工栽培基地。2012年(1年生)從4月下旬開始，2013年(2年生)因化凍晚從5月初開始，于月初和中旬各取樣1次，連續(xù)取樣至10月初；分別采集白鮮全株樣品(按田間隨機區(qū)組試驗設(shè)計，設(shè)置3次重復(fù)，采集樣本量10株)，地上、地下部分分開，洗凈；趁鮮時縱向剖開，抽去木心、烘干、粉碎，過篩備用。

對照品溶液的制備：取黃柏酮對照品、梣酮對照品適量，精密稱量，加甲醇，分別制成每1 mL含黃柏酮0.1 mg、梣酮60 μg的溶液，即得對照品溶液。

供試品溶液的制備：取本品粉末約1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱量質(zhì)量。加熱回流1 h，放冷，再稱量質(zhì)量；用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

專屬性考察：分別取對照品溶液、供試品溶液，注入液相色譜儀中，按色譜條件，進(jìn)樣10 μL，結(jié)果見圖1?？梢?，在此條件下，黃柏酮和梣酮分離較好，在各出峰處無干擾。

1為黃柏酮；2為梣酮。

線性試驗：分別精密稱取黃柏酮和梣酮對照品9.92、11.98 mg，分別置10 mL量瓶中，用甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液；分別精密量取黃柏酮對照品儲備液1.0 mL、梣酮對照品儲備液0.5 mL，置同一10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品混合溶液。分別吸取對照品溶液2、4、8、12、16、20 μL，按上述色譜條件測定。分別以黃柏酮和梣酮進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，經(jīng)線性回歸得，回歸方程分別為y=1 862 386.88x+2 571.70，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6；y=8 914 935.52x-7 887.17，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7；黃柏酮在0.198 4～1.984 0 μg、梣酮在0.119 8～1.198 0 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取白鮮皮2012年10月6日樣品，按照上述質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)行6次測定，測定峰面積，計算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。黃柏酮相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.98%、梣酮相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.92%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取上述白鮮皮樣品，按上述質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法制備供試品溶液，測定0、2、4、6、8、10 h峰面積，計算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。黃柏酮相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.29%、梣酮相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.64%，表明在10 h內(nèi)供試品穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取上述白鮮皮樣品，按上述質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法制備供試品溶液，獨立進(jìn)行6次測定，計算其峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。黃柏酮相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.60%、梣酮相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.62%，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收率試驗：精密稱取上述白鮮皮樣品6份，分別加入一定量的對照品溶液，按上述樣品制備方法制備供試品溶液，并按照上述色譜條件測定，計算平均回收率。黃柏酮相對平均回收率為98.95%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.45%；梣酮相對平均回收率為98.22%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.46%。表明該方法準(zhǔn)確、可靠，符合要求。

樣品測定：按照“供試品溶液的制備”方法，對2012年和2013年不同白鮮皮樣品中黃柏酮和梣酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行了測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長階段白鮮皮中黃柏酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化規(guī)律

由圖2可見：2年生(2013年樣品)白鮮根皮中黃柏酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)除個別點外，均高于1年生(2012年樣品)的。2012年和2013年，均是7月8日果期黃柏酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)最高水平，分別為0.212%和0.294%；其次2012年5月9日和7月23日，黃柏酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均超過0.203%；2013年是7月23日和6月22日，黃柏酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均超過0.267%?？菸?，白鮮皮中黃柏酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至最低點：2012年出現(xiàn)在10月6日，黃柏酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.156%；2013年則是9月6日，黃柏酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.168%。在6月初至8月底，黃柏酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有一次較明顯波動。

從年生育期看，2012年的樣品，因為是1年生苗，生長量較小，所以全年黃柏酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變幅較小，最高與最低相差0.056%。2013年2年生的白鮮，株形大，枝葉茂盛，根系吸收和積蓄的養(yǎng)分量也增加，表現(xiàn)出：一是全年黃柏酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)波動較大；二是白鮮根皮中黃柏酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)全年基本都高于1年生的；兩年的最高點相差0.08%，最低點相差較小，近0.01%。

從全年看，6月初到8月底，營養(yǎng)生長和生殖生長最旺盛的時期，黃柏酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有一次波動，2年生苗黃柏酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的波動幅度大于1年生苗的波動幅度。5月初萌芽后，地上部分展枝抽葉生長量增大，根皮中黃柏酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨生長的加速，逐漸下降；8月底地上部分停止生長，進(jìn)入枯萎期，根皮中黃柏酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)緩慢回升。

圖2 白鮮皮中黃柏酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化規(guī)律

2.2 不同生長階段白鮮皮中梣酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化規(guī)律

由圖3可見：2年生白鮮根皮中梣酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)除5月初外，均高于1年生的。2個年份，均是6月8日花期梣酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)最高水平，分別為0.072%和0.08%；其次，2012年是5月9日和6月23日，梣酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)均超過0.06%；2013年為6月23日和5月24日，梣酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)均超過0.07%。白鮮皮中梣酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低點，1年生(2012年)的出現(xiàn)在10月6日，為0.036%；2年生(2013年)的出現(xiàn)在10月6日，為0.043%。

圖3 白鮮皮中梣酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化規(guī)律

從年生育期看，2個年份的白鮮皮中梣酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的年變化規(guī)律基本相同。與黃柏酮不同，2個年份的白鮮皮中梣酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)有2次波動：5月初萌芽至7月初果期，波動較明顯，最高與最低點，2012年相差0.018%、2013年相差0.029%；7月初到8月底，營養(yǎng)生長遲緩，有1次小幅波動，最高與最低相差不到0.003%。

從全年看，5月初萌芽后，地上部分生長量增大，根皮中梣酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨生長的加速，逐漸增加，6月初花期時達(dá)到最高點；8月底，地上部分開始枯萎后，根皮中梣酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)緩慢回升，與春季相接近。

3 結(jié)論與討論

在2012年、2013年2個年份中，2013年的樣品，因為生長時間長，積累多，所以白鮮皮中梣酮和黃柏酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于2012年的。同一種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在不同年份的變化基本相同；梣酮和黃柏酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)年變化規(guī)律不同，大體呈相反的趨勢，6月5日梣酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，而黃柏酮則近于最低點。2種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在地上部分開始枯萎時，均緩慢回升。

白鮮皮作為一種常用藥材，根皮入藥，2010版《中華人民共和國藥典》規(guī)定黃柏酮不得少于0.15%、梣酮不得少于0.05%[6]。1年生和2年生的白鮮根皮中黃柏酮均達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)，1年生的梣酮積累量在秋季略低于藥典指標(biāo)。從本研究結(jié)果可以看出，隨生長年限增加，活性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也在增加，但2年生的白鮮，根皮的產(chǎn)量低，不是合理的采收年限。從采收季節(jié)看，雖然梣酮和黃柏酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高是在6月和7月，但藥材生產(chǎn)上，一般都是春季或秋季采收，而且春季和秋季活性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)接近；為得到優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、高效的白鮮皮，白鮮的生長年限應(yīng)在2年以上，根據(jù)產(chǎn)地實際情況，春季或秋季采收均可。

[1] 周繇.中國長白山植物資源志[M].北京：中國林業(yè)出版社，2009：325.

[2] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中草藥大辭典：上冊[M].上海：上海人民出版社，1977：737.

[3] 杜程芳，楊欣欣，屠鵬飛.白鮮皮的化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志，2005(21)：1663-1666.

[4] 王麥玲，張繼文，錢勇，等.白蘚皮殺菌活性成分的研究[J].農(nóng)藥，2006，45(11)：739-741.

[5] 周穗文，陳群雄，岑幗英.復(fù)方白鮮皮乳膏的制備及臨床應(yīng)用[J].中國實用醫(yī)藥，2008，3(11)：90-91.

[6] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄102.

Variation Laws of the Content of Obacunone and Fraxinellone in Dictamni Cortex at Different Growth Stages

Liu Lijuan(School of Life Sciences, Tonghua Normal University, Tonghua 134002, P. R. China); Zhang Guohong(Soil Fertilizer Station of Jiutai, Jilin); Sun Wenyi(Jilin University); Nan Minlun, Zhao Yuwei, He Yufang(Academy of Chinese Medical Sciences of Jilin Province)/Journal of Northeast Forestry University，2015,43(4)：131-133.

We extracted obacunone and fraxinellone in Dictamni Cortex collected in two consecutive years by the heating reflux method, and determined their content by HPLC. The accumulation of obacunone and fraxinellone in Dictamni Cortex was positive correlated with the growth age, and annual variation of the same component above mentioned is almost the same. Annual change pattern of obacunone and fraxinellone in Dictamni Cortex was more different, and the accumulation of two components in different growth stages of the same growth period was significantly different. The accumulation of obacunone in fruit and fraxinellone in flowering was the highest. Dictamni Cortex can be harvested in spring or autumn and one of three-year old or more is suitable to harvest.

Dictamni Cortex; HPLC; Obacunone; Fraxinellone

劉麗娟，女，1972年12月生，通化師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，副教授。E-mail：liulijuan214@163.com。

赫玉芳，吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，研究員。E-mail：hyf_1992@163.com。

2014年11月6日。

Q946； R282.5

1)吉林省科技發(fā)展計劃重點項目(20110902)。

責(zé)任編輯：張 玉。