引進(jìn)觀賞芍藥新種質(zhì)的SSR指紋圖譜構(gòu)建1)

張建軍 季麗靜

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083) (國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心(北京林業(yè)大學(xué)))

劉仲赫 周明潔 王雅麗 于曉南

(北京景山公園) (北京林業(yè)大學(xué))

引進(jìn)觀賞芍藥新種質(zhì)的SSR指紋圖譜構(gòu)建1)

張建軍 季麗靜

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083) (國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心(北京林業(yè)大學(xué)))

劉仲赫 周明潔 王雅麗 于曉南

(北京景山公園) (北京林業(yè)大學(xué))

采用SSR標(biāo)記構(gòu)建從歐美等地區(qū)引進(jìn)、收集的61份觀賞芍藥新種質(zhì)的指紋圖譜。根據(jù)引物的多態(tài)性信息含量和Shannon遺傳多樣性指數(shù)大小，從15對(duì)候選引物中篩選出10對(duì)多態(tài)性高且穩(wěn)定性好的引物作為核心引物，首次構(gòu)建了61個(gè)觀賞芍藥新種質(zhì)指紋圖譜，并編制了指紋代碼。結(jié)果表明：被試種質(zhì)資源的倍型豐富，有一條帶、兩條帶，甚至出現(xiàn)了三條帶、四條帶；所繪制的圖譜能夠?qū)⑺衅贩N(種)完全區(qū)分開(kāi)。

芍藥新種質(zhì)；SSR；引物；DNA指紋圖譜；品種鑒定

We used SSR markers to construct the fingerprint of 61 ornamental peony resources mainly collected from European and North American regions. With the polymorphism information and Shannon diversity indexes of primer, we selected 10 pairs of primers from 15 candidates as core primers with high polymorphism and good stability. Fingerprint of 61 new peony resources were first built and fingerprint code was compiled. The ploidy type were with rich varieties including one, two, three and four belts. The map could be used to distinguish all the cultivars (species), and identify the cultivars and ploidy diversity, and provides utility guideline for new peony resources.

芍藥自先秦以來(lái)就有記載，是深受我國(guó)人民喜愛(ài)的傳統(tǒng)名花[1]。其花容俏麗，花姿富貴，自古就有“花相”之譽(yù)[2]。在世界范圍內(nèi)，芍藥也是廣受歡迎的優(yōu)良花卉，在西方園藝界，芍藥遠(yuǎn)比牡丹享譽(yù)盛名[3-4]。隨著市場(chǎng)的開(kāi)放，芍藥優(yōu)良的觀賞特性和切花品質(zhì)逐漸為世界各地越來(lái)越多的人們認(rèn)識(shí)，市場(chǎng)需求空前提高[5]。

芍藥種質(zhì)資源豐富，從全世界范圍來(lái)看，按其種源組成不同分為中國(guó)芍藥品種群、歐洲芍藥品種群、雜種芍藥品種群三類[6-7]。與單一起源(Paeonia.lactiflora)的中國(guó)芍藥品種群相比，歐洲及雜種芍藥品種群混合了P.lactiflora以外的種源，文中的觀賞芍藥新種質(zhì)，特指芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(PaeoniaL.)芍藥組(Sect. Paeonia)中的多年生宿根花卉，它們均來(lái)自歐洲、美洲等地區(qū)，其親本混合了P.lactiflora以外的種源，很多原種或品種都曾作為重要親本參與了世界芍藥品種的培育，在觀賞特性和生態(tài)適應(yīng)性方面表現(xiàn)優(yōu)異，極大豐富了芍藥屬種質(zhì)資源。因而，在觀賞特性和生態(tài)適應(yīng)性方面與單一起源的中國(guó)芍藥品種群有較大差異。然而，歐美芍藥品種由于長(zhǎng)期育種栽培，遺傳背景復(fù)雜，加上大多品種收集者為苗圃主或園藝愛(ài)好者，有些品種育種年代久遠(yuǎn)，育種記錄缺失等，使得親緣關(guān)系模糊，品種間的遺傳差異越來(lái)越小，僅僅依據(jù)形態(tài)進(jìn)行品種間的田間檢測(cè)越來(lái)越困難。同時(shí)，由于形態(tài)鑒定的時(shí)效性差，容易受到環(huán)境和主觀因素的影響[8]，導(dǎo)致品種混淆的問(wèn)題越來(lái)越突出，使得后續(xù)的育種及應(yīng)用受到了較大的限制[9]。DNA指紋圖譜主要是指基于DNA基礎(chǔ)上的某一個(gè)品種區(qū)別于其他品種的特異性DNA片段[10]，因其簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確可靠以及便于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，使得其在觀賞植物種質(zhì)鑒定中受到廣泛的應(yīng)用[11-13]。已經(jīng)運(yùn)用RAPD、SCAR、AFLP、SSR等分子標(biāo)記手段成功開(kāi)展了大量的研究[14-18]。與其他分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記重復(fù)性與多態(tài)性好，在基因組中豐度較高，以孟德?tīng)柗绞竭z傳，呈現(xiàn)共顯性等優(yōu)點(diǎn)而在DNA指紋鑒定上顯示了其獨(dú)特的優(yōu)越性[19]。目前，指紋圖譜在觀賞芍藥中研究較少，僅朱紅霞等[20]運(yùn)用AFLP技術(shù)開(kāi)展過(guò)相關(guān)研究，而針對(duì)SSR標(biāo)記進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建的研究還未有相關(guān)的報(bào)道。

本試驗(yàn)通過(guò)SSR標(biāo)記構(gòu)建觀賞芍藥部分新種質(zhì)指紋圖譜，為進(jìn)行種質(zhì)鑒定和品種倍性輔助分析提供了技術(shù)支持，也對(duì)理清芍藥品種親緣關(guān)系，科學(xué)利用新優(yōu)種質(zhì)資源，推動(dòng)育種工作的深入開(kāi)展積累了研究基礎(chǔ)，具有重要意義。

1 材料與方法

所有61份芍藥新優(yōu)種質(zhì)資源分別來(lái)自荷蘭、美國(guó)、加拿大、日本，目前均栽種于國(guó)家花卉工程研究中心(北京林業(yè)大學(xué))芍藥種質(zhì)資源苗圃中(北京，小湯山)和北京景山公園(表1)。

表1 芍藥新優(yōu)種質(zhì)資源

DNA提取：芍藥遺傳多樣性研究中采用不需要經(jīng)過(guò)水浴和氯仿抽提的試劑盒法(天根，DP320)進(jìn)行芍藥品種基因組DNA提取，操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取芍藥基因組DNA后(圖1)，置于冰箱-20 ℃，備用。

M為DNA標(biāo)記DL2000；1-6為芍藥葉片DNA提取效果。

引物篩選：利用聚丙烯酰胺凝膠電泳法對(duì)芍藥遺傳多樣性研究中運(yùn)用磁珠富集法設(shè)計(jì)、開(kāi)發(fā)的50對(duì)SSR引物進(jìn)行多態(tài)性篩選(圖2)，初步篩選出來(lái)15對(duì)多態(tài)性引物(表2)作為進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建研究的候選引物。

圖2 多態(tài)性引物的篩選

熒光引物檢測(cè)：將開(kāi)發(fā)的15對(duì)引物應(yīng)用于61份材料，均擴(kuò)增出清晰的條帶(圖3)。

SSR-PCR擴(kuò)增：將所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)采用優(yōu)化的25 μL體系。反應(yīng)液中包括：17.8 μL ddH2O、2.5 μL 10×PCR buffer、1.7 μL MgCl2(2.5 mmol)、0.6 μL Forward primer(10 μmol)、0.6 μL Reverse primer(10 μmol)、0.5 μL dNTPs(2.5 mmol each)、1.0 μL模板DNA和0.3 μL Taq DNA聚合酶。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；共35個(gè)循環(huán)。72 ℃延伸5 min；10 ℃保存待用。將V(PCR產(chǎn)物)∶V(98%甲酰胺+10 mmol EDTA ph8.0+0.25%溴酚藍(lán)+0.25%二甲苯青)=5∶5混合后迅速放入PCR儀中95 ℃變性5 min；分離取出變性產(chǎn)物立即放入冰水混合物中待用；插梳，采用排槍小心上樣，恒功率90 W電泳70 min。銀染檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

表2 15對(duì)芍藥SSR標(biāo)記引物序列(篩選后)

注：引物序號(hào)按微衛(wèi)星序列數(shù)1-63編號(hào)，列出的為重復(fù)序列8個(gè)以上可用于設(shè)計(jì)引物的50個(gè)微衛(wèi)星中篩選后的15個(gè)候選引物序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

2.2 指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù)引物多樣性信息篩選核心引物和SSR擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠上的相對(duì)位置，參照宋紅梅等[21]、雷天剛等[22]的方法分別對(duì)引物與顯示的譜帶進(jìn)行賦值，并按照數(shù)字與字母結(jié)合的方法排序，編寫(xiě)指紋代碼(表4)，利用Excel2010版作圖工具，繪制了61個(gè)芍藥品種的DNA指紋圖譜。所構(gòu)建的指紋圖譜能夠很好地代表各品種的特異性。

圖3 引物在不同個(gè)體內(nèi)的熒光檢測(cè)

本試驗(yàn)通過(guò)采用上述10對(duì)引物對(duì)61個(gè)芍藥品種(種)進(jìn)行指紋分析。從繪制的指紋圖譜中可知，這些芍藥新種質(zhì)不再是傳統(tǒng)意義上僅有一條帶、兩條帶的二倍體類型，而是出現(xiàn)了三條帶、四條帶。從細(xì)胞水平上可知，芍藥倍型非常豐富，已知的野生種中就有二倍體種，如P. lactiflora、P. tenunata、P. sterniana，四倍體種P. officinalis、P. dauricasubsp. macrophylla、P. peregrina等，故其品種的倍性必然也會(huì)多樣化。歐美地區(qū)培育芍藥新品種因其野生種源倍性的多樣化，其品種也呈現(xiàn)多樣性趨勢(shì)?！瓾alcyon’在sy16、sy45、sy55等三條引物中表現(xiàn)三條帶；‘HenryBockstoce’在sy16、sy42、sy44、sy55四條引物中表現(xiàn)出三條帶；‘CreamDelight’在sy16、sy32、sy44、sy45、sy55等五條引物中也表現(xiàn)出了三條帶；‘Sunshine’在sy45、sy55兩條引物中表現(xiàn)出了四條帶。由此可以推測(cè)，‘Halcyon’‘CreamDelight’‘HenryBockstoce’和‘Sunshine’至少為三倍體或四倍體品種。引物sy45和sy55在‘Halcyon’‘HenryBockstoce’‘CreamDelight’‘Sunshine’4個(gè)多倍體品種上均表現(xiàn)出特征譜帶，表明這兩個(gè)引物多態(tài)性豐富的同時(shí)，特征譜帶也多，可考慮將這兩個(gè)多態(tài)性引物在構(gòu)建指紋圖譜、進(jìn)行品種鑒定時(shí)進(jìn)行優(yōu)先應(yīng)用。最終所繪制的圖譜能夠?qū)⑺斜辉嚻贩N(種)完全區(qū)分開(kāi)來(lái)。

表3 特征引物的遺傳多樣性參數(shù)

表4 芍藥新種質(zhì)的指紋代碼

續(xù)(表4)

3 結(jié)論與討論

SSR標(biāo)記的指紋圖譜在親緣關(guān)系、品種及倍性鑒定等方面都具有較為廣泛的應(yīng)用[23-25]。目前，在芍藥屬內(nèi)開(kāi)展的相關(guān)工作還不夠，僅朱紅霞[20]利用AFLP反應(yīng)體系繪制了5個(gè)牡丹品種和6個(gè)芍藥品種的指紋圖，但遺憾的是，由于供試個(gè)體較少，研究結(jié)果很難真正反映芍藥、牡丹之間的遺傳背景，制約了后續(xù)相關(guān)研究的推進(jìn)。本試驗(yàn)以歐美引進(jìn)的觀賞芍藥新種質(zhì)為材料，在引種的過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)遇到“同物異名”或者兩個(gè)品種表型觀賞性狀非常相似、無(wú)法確定其真實(shí)身份的情況。這些情況說(shuō)明了，在植物中開(kāi)展從表型到DNA分子水平的多方位的種質(zhì)研究和鑒定工作不僅是可能的，也是基于實(shí)際研究應(yīng)用的需要。其中，通過(guò)開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記，構(gòu)建指紋圖譜是一條有效的途徑。

試驗(yàn)通過(guò)獲得15個(gè)SSR位點(diǎn)上的遺傳多樣性信息并根據(jù)PIC多態(tài)性含量和Shannon遺傳多樣性指數(shù)大小信息，從15對(duì)候選引物中篩選10對(duì)特征引物，通過(guò)采用數(shù)字與字母結(jié)合排序的方法進(jìn)行DNA指紋圖譜的構(gòu)建，開(kāi)創(chuàng)了運(yùn)用新的可靠方法構(gòu)建芍藥指紋圖譜進(jìn)行種質(zhì)鑒定和倍性分析的先例，突破了表型進(jìn)行品種分類鑒定的瓶頸，為DNA指紋技術(shù)應(yīng)用于芍藥種質(zhì)鑒定奠定了應(yīng)用基礎(chǔ)，為觀賞芍藥進(jìn)行良種檢測(cè)以及保護(hù)育種者權(quán)益提供了一個(gè)有效的輔助分析手段。

由于開(kāi)發(fā)標(biāo)記的數(shù)目有限，同時(shí)也受到檢測(cè)技術(shù)的限制，開(kāi)發(fā)SSR引物也存在一定的難度，本試驗(yàn)提供的指紋圖譜是建立在10個(gè)特征引物的基礎(chǔ)之上的，引物個(gè)數(shù)畢竟太少，僅能體現(xiàn)部分特征。同時(shí)，構(gòu)建的指紋圖譜主要以DNA的多態(tài)性為主，缺少表型形態(tài)數(shù)據(jù)。而且，一般品種倍性的確認(rèn)主要是靠核型分析及染色體數(shù)目的分析，僅從分子水平上判斷其倍性證據(jù)不足，單純的指紋圖譜僅能作為判斷其倍性的一個(gè)輔助分析手段。為了豐富該指紋圖譜的信息，非常有必要加大試驗(yàn)投入，不斷增加SSR位點(diǎn)數(shù)目及群體樣本個(gè)數(shù)，增加標(biāo)記的方法和種類，加快各種新型標(biāo)記方法(EST-SSR、cpSSR、nSSR、SRAP)的探索和應(yīng)用，提高指紋圖譜的可靠性，不斷完善芍藥指紋圖譜系統(tǒng)。

致謝：感謝花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))為本試驗(yàn)提供部分試驗(yàn)條件。

[1] 汪菊淵.芍藥史話[J].世界農(nóng)業(yè),1984(5):52-54.

[2] 李嘉玨.中國(guó)牡丹與芍藥[M]．北京:中國(guó)林業(yè)出版社,1999:29-67.

[3] 于曉南,苑慶磊,宋煥芝.中西方芍藥栽培應(yīng)用簡(jiǎn)史及花文化比較研究[J].中國(guó)園林,2011,27(6):77-81.

[4] 于曉南，苑慶磊，郝麗紅.芍藥作為中國(guó)愛(ài)情花之史考[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：社會(huì)科學(xué)版，2014,13(2):36-31.

[5] 郭先鋒,王蓮英.觀賞芍藥應(yīng)用研究的進(jìn)展[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004,24(1):85-88.

[6] 秦魁杰.芍藥[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社,2004：2-19.

[7]Wangqi，ChengTangren，YuXiaonan，etal.Physiologicalandbiochemicalresponsesofsixherbaceouspeonycultivarstocoldstress[J].SouthAfricanJournalofBotany，2014，94：140-148.

[8] 匡猛,楊偉華,許紅霞,等.中國(guó)棉花主栽品種DNA指紋圖譜構(gòu)建及SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44(1):20-27.

[9] 于曉南,季麗靜,王琪.芍藥屬植物分子水平遺傳多樣性研究進(jìn)展[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,34(3):130-136.

Constructing SSR Fingerprinting for Introduced New Germplasm ofPaeoniaL.

Zhang Jianjun(Beijing Forestry University, Beijing 100083, P. R. China); Ji Lijing(National Engineering Research Center for Floriculture); Liu Zhonghe, Zhou Mingjie, Wang Yali(Beijing Jingshan Park); Yu Xiaonan(Beijing Forestry University)/Journal of Northeast Forestry University，2015,43(3)：70-74.

New germplasms;PaeoniaL.; SSR; Primer; Fingerprinting; Identification of cultivars

1)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(YX2014-20)、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31400591)。

張建軍，男，1990年1月生，北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，碩士研究生。E-mail：zhang727jianjun@126.com。

于曉南，北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，教授。E-mail：yuxiaonan626@126.com。

2014年9月8日。

S682.1+2; Q343

責(zé)任編輯：任 俐。