火雞皰疹病毒SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

劉杉杉，孫 偉，閆敏鑫，黃秀芬，姜 良，何 誠，李永清*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，畜禽疾病防控技術(shù)北京市重點(diǎn)實驗室，北京 100097；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

火雞皰疹病毒SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

劉杉杉1,2，孫 偉1，閆敏鑫1，黃秀芬1，姜 良1，何 誠2，李永清1*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，畜禽疾病防控技術(shù)北京市重點(diǎn)實驗室，北京 100097；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

針對火雞皰疹病毒(HVT)特異性的sorf1區(qū)基因序列設(shè)計引物，建立檢測HVT的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法，并對其特異性、敏感性和重復(fù)性進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，建立的實時熒光定量 PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的循環(huán)閾值(Ct)與模板拷貝數(shù)呈良好線性關(guān)系(r2=0.99)，熔解曲線分析顯示該P(yáng)CR擴(kuò)增具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，試驗表明該方法最低檢測濃度為7×101拷貝/μL。利用該方法對野生型HVT和rHVT-pmpD-N在體內(nèi)和體外的復(fù)制特性進(jìn)行檢測，結(jié)果表明重組后的HVT與野生型HVT的增殖速度基本一致。本試驗建立的檢測方法能夠快速檢測HVT，準(zhǔn)確率高，特異性好，具有較高的靈敏度和穩(wěn)定性，為監(jiān)測HVT體內(nèi)和體外的病毒含量和復(fù)制情況提供了一種有效的手段。

火雞皰疹病毒；SYBR Green Ⅰ；實時熒光定量PCR；sorf1

馬立克病(Marek' disease, MD)是一種由馬立克病病毒(Marek' disease virus, MDV)引起的雞淋巴組織增生性傳染病[1]。根據(jù)血清學(xué)特性將MDV分為3個血清型，Ⅰ型為具有致瘤性的MDV，Ⅱ型為天然無致瘤MDV，Ⅲ型為火雞皰疹病毒(Herpesvirus of turkey, HVT)。雞是MDV最重要的天然宿主，商品化雞群感染以T細(xì)胞淋巴瘤和嚴(yán)重的免疫抑制為特點(diǎn)。20世紀(jì)70年代，從家養(yǎng)火雞中分離到一種自然發(fā)生的非致病性的MDV毒株即HVT，并用作疫苗來預(yù)防MDV感染，取得了良好效果。此后，HVT疫苗及以HVT為載體的多價疫苗得了到廣泛使用和研究[2-7]。這些疫苗在一定程度上可以有效地控制MD的流行，阻止臨床癥狀的發(fā)展，抑制腫瘤的形成，并可以減少淋巴器官中病毒粒子的數(shù)量，但不能抑制MDV的感染及其在雞體內(nèi)的復(fù)制[8]。

HVT能夠?qū)е码u胚成纖維細(xì)胞(chicken embryo fibroblast，CEF)發(fā)生病變，體外通常采用蝕斑技術(shù)對HVT疫苗免疫效力和增殖情況進(jìn)行檢測[9]，但該方法準(zhǔn)確性低，重復(fù)性差，易受許多因素的影響，如雞胚、外界病原、pH、瓊脂覆蓋量和病毒稀釋液等，而且試驗操作繁瑣、周期性長，很難應(yīng)用于大量樣品的檢測。HVT的體內(nèi)定量檢測主要是通過實時熒光定量PCR檢測方法[10]，Susan等建立的探針法熒光定量PCR方法省時省力，可以實現(xiàn)快速檢測的目的，但是探針的合成比較昂貴，設(shè)計難度大。

HVT基因組為雙鏈DNA，基因組結(jié)構(gòu)與其他α皰疹病毒類似，由一個長獨(dú)特區(qū)(UL)及其兩側(cè)的末端長重復(fù)序列(TRL)/內(nèi)部重復(fù)序列(IRL)，和一個短獨(dú)特區(qū)(US)及其兩測的末端短重復(fù)序列(TRS)/內(nèi)部短重復(fù)序列(IRS)所組成。HVT與MDV-1都包含有76個基因同源物，大部分位于UL和US區(qū)，其中sorf1基因為HVT所特有，可用于對HVT進(jìn)行檢測。

目前，尚缺乏一種快速、簡捷檢測HVT疫苗中活病毒的含量，并可準(zhǔn)確定量其增殖情況的方法[11]。本試驗通過構(gòu)建HVT的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，利用SYBR Green Ⅰ特異性結(jié)合到DNA分子上的特性，建立一種實時熒光定量 PCR檢測方法，為檢測體內(nèi)外HVT的病毒含量和增殖提供有效手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 HVT-BAC細(xì)胞毒，即將HVT的完整基因組構(gòu)建在BAC載體上，由英國動物健康研究所Venugopal Nair教授贈送；rHVT-pmpD-N細(xì)胞毒，是將鸚鵡熱衣原體CB7的pmpD-N基因插入HVT-BAC中獲得的重組毒，由本實驗室構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑 pMD○R18-T Simple載體為TaKaRa公司產(chǎn)品；ExTaqDNA聚合酶為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品；iTaqTMUniversal SYBR○RGreen Supermix試劑盒為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備 PCR儀(MT Mini)、數(shù)碼凝膠圖像處理儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；超純水系統(tǒng)(Milli-Q Integral)為Millipore公司產(chǎn)品；微量紫外分光光度計(Nanodrop 2000)為Gene公司產(chǎn)品；Bio-Rad iQ 5熒光定量PCR儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR引物的設(shè)計 根據(jù)GenBank登錄的HVT FC126毒株(AF282130)的sorf1區(qū)序列，應(yīng)用Primer 5.0和DNAStar設(shè)計引物。引物如下：sorf1 F(上游引物)：5′-AGTCTCGAGCGTGGACAGAT-3′；sorf1 R(下游引物)：5′-CCAAACGTCCGTAGACGAAT-3′。預(yù)期擴(kuò)增片段為175 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備及鑒定 從HVT-BAC細(xì)胞毒中提取DNA，具體操作過程參照Qiagen公司DNA提取試劑盒步驟進(jìn)行。以提取的HVT-BAC基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL：ddH2O 15 μL，10×ExTaqbuffer 2.5 μL，dNTP 3 μL，上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物 (10 μmol/L)1 μL，DNA模板2 μL，ExTaqDNA polymerase 0.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 10 s，進(jìn)行30個循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。

擴(kuò)增結(jié)束后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL 6×DNA Loading buffer混合，加入20 g/L瓊脂糖凝膠孔中，同時加入DNA Ladder 2000作為Marker，紫外分析儀進(jìn)行觀察。

將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后與pMD○R18-T Simple載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞。PCR鑒定為陽性的單菌落送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，并采用DNA Star軟件將測序結(jié)果與目的序列進(jìn)行比對。

將測序正確的菌液，小量提取質(zhì)粒。將提取后的含有sorf1基因的重組質(zhì)粒命名為p-sorf1。紫外分光光度計Nanodrop 2000測定質(zhì)粒的濃度和純度，并參考以下公式計算基因的拷貝數(shù)：單位體積質(zhì)?？截悢?shù)(拷貝/μL)=6.02×1023(ng/μL×10-9)/堿基數(shù)×660。將已經(jīng)計算好拷貝數(shù)的陽性質(zhì)粒p-sorf1做梯度稀釋，即濃度分別為：7×107、7×106、7×105、7×104、7×103、7×102、7×101拷貝/μL，作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.3 優(yōu)化反應(yīng)體系 在同一濃度模板的反應(yīng)體系中，采用正交試驗法分別對引物濃度和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 以上述10倍梯度稀釋的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，利用優(yōu)化的反應(yīng)條件，進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

1.2.5 敏感性試驗 將重組質(zhì)粒10倍梯度稀釋，分別以7×107、7×106、7×105、7×104、7×103、7×102、7×101、7×100拷貝/μL為模板，利用優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量，以檢測結(jié)果陽性的最高稀釋度的質(zhì)粒濃度作為檢測下限。

1.2.6 重復(fù)性試驗 將重組質(zhì)粒分別做3次稀釋，選取7×107、7×106、7×105、7×104、7×103、7×102、7×101拷貝/μL重組質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行重復(fù)性試驗，并對各個濃度標(biāo)準(zhǔn)品的閾值(Ct值)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.7 試驗樣本檢測 將構(gòu)建好的rHVT-pmpD-N和野生型HVT以400 PFU同時分別接種CEF細(xì)胞，收集感染后12、24、48、72、96、120 h的細(xì)胞。提取DNA，并進(jìn)行含量測定。測定后將含量統(tǒng)一稀釋到1 ng/μL，對不同時間段的病毒含量進(jìn)行檢測。同時將收集的不同時間的細(xì)胞進(jìn)行蝕斑檢測。

將35只1日齡SPF雞隨機(jī)分成3組，對照組10只，以1.3×105/只劑量背部皮下接種CEF細(xì)胞。試驗組一10只，相同部位按照劑量為8 000 PFU/只接種野生型HVT。試驗組二15只，同一部位以8 000 PFU/只劑量接種rHVT-pmpD-N。所有雞只，每周采用肝素鈉抗凝采血，每只雞1 mL，共采集5次，分別進(jìn)行淋巴細(xì)胞的分離。試劑盒提取DNA后，經(jīng)含量測定后，均稀釋到到15 ng/μL，利用建立的方法對不同時間段的病毒含量進(jìn)行檢測。

為了證實該方法的特異性，本試驗采用Qiagen公司DNA提取試劑盒，從MDV CVI988/Rispens病毒株及其細(xì)菌人工染色體感染的細(xì)胞中提取DNA，利用此方法對提取的DNA進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備及鑒定

普通PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增后，經(jīng)20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，可擴(kuò)增出約175 bp的特異性條帶，與目的片段大小一致(圖1)。

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000； 1.陰性對照； 2. sorf1基因的PCR產(chǎn)物

M. DNA Maker DL 2 000; 1. Negative control; 2. PCR product of gene sorf1

圖1 sorf1基因PCR產(chǎn)物電泳圖
Fig.1 Electrophoresis of PCR product of sorf1 gene

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，克隆于pMD○R18-T Simple載體中，得到的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，結(jié)果表明與GenBank上HVT FC126毒株(AF282130)的sorf1區(qū)序列的基因片段序列同源性為100%，表明成功獲得目的基因片段。

提取的質(zhì)粒DNA經(jīng)紫外分光光度計測定后，濃度為245.3 ng/μL，OD260 nm/OD280 nm比值為1.89，符合純度要求。經(jīng)計算該陽性重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)為7.8×1010拷貝/μL。

2.2 反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)動力學(xué)曲線和擴(kuò)增效率判定優(yōu)化的結(jié)果，最終確定反應(yīng)體系為20 μL，即iTaqTMUniversal SYBR○RGreen Supermix 10 μL，上游引物(3 μmol/L)1 μL，下游引物(3 μmol/L)1 μL，質(zhì)粒p-sorf1 5 μL，ddH2O 3 μL。最佳反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；4 ℃結(jié)束反應(yīng)。

2.3 Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將p-sorf1重組質(zhì)粒做梯度稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋濃度分別為7×107、7×106、7×105、7×104、7×103、7×102、7×101、7×100拷貝/μL，以各個濃度的質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗結(jié)果顯示，可以獲得較為理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)；熔解曲線表明產(chǎn)物的Tm值非常均一(圖3)，說明擴(kuò)增的效率一致；Ct值和標(biāo)準(zhǔn)陽性模板拷貝數(shù)的對數(shù)間有良好的線性關(guān)系(R2為0.99)(圖4)，且擴(kuò)增效率理想(經(jīng)計算擴(kuò)增效率為81.7%)(圖4)，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠準(zhǔn)確反映目的產(chǎn)物的擴(kuò)增。

2.4 敏感性及特異性分析

將重組質(zhì)粒10倍梯度稀釋，分別以7×107、7×106、7×105、7×104、7×103、7×102、7×101、7×100拷貝/μL為模板，利用優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量，檢測結(jié)果陽性的最高稀釋度的質(zhì)粒濃度為7×101拷貝/μL(圖2)，而標(biāo)準(zhǔn)PCR的檢測敏感性為7×102拷貝/μL，real-time PCR比常規(guī)PCR的敏感性提高10倍。利用此方法對MDV CVI988/Rispens 株的病毒DNA 及其細(xì)菌人工染色體進(jìn)行了檢測，結(jié)果均為陰性，說明該方法可以用于對HVT和CVI988病毒鑒別。

1.7×107拷貝/μL；2.7×106拷貝/μL；3.7×105拷貝/μL；4.7×104拷貝/μL；5.7×103拷貝/μL；6.7×102拷貝 /μL；7.7×101拷貝/μL；8.陰性對照

1.7×107copies/μL；2.7×106copies/μL；3.7×105copies /μL；4.7×104copies/μL；5.7×103copies/μL；6.7×102copies/μL；7.7×101copies/μL；8.Negative control

圖2 p-sorf1重組質(zhì)粒real-time PCR擴(kuò)增曲線
Fig.2 Amplification curve of SYBR Green Ⅰ real-time PCR for detection of p-sorf1

圖3 p-sorf1重組質(zhì)粒real-time PCR熔解曲線導(dǎo)數(shù)圖Fig.3 Melt curve derivative plot of SYBR Green Ⅰ real-time PCR for detection of p-sorf1

圖4 p-sorf1的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Real-time PCR standard curve of p-sorf1

2.5 重復(fù)性分析

將重組質(zhì)粒分別做3次稀釋，選取7×107、7×106、7×105、7×104、7×103、7×102、7×101拷貝/μL重組質(zhì)粒作為模板，結(jié)果見表1。由表1可知，Ct值的變異系數(shù)為0.16%～1.44%，說明無論質(zhì)粒濃度高低，都能獲得較好的重復(fù)性。

表1 p-sorf1重組質(zhì)粒real-time PCR重復(fù)性試驗數(shù)據(jù)分析Table 1 The Ct analysis of reproducibility for p-sorf1 real-time PCR

2.6 試驗樣品的分析

將rHVT-CMV-pmpD和野生型HVT以400 PFU同時分別接種CEF細(xì)胞，收集感染后12、24、48、72、96、120 h的細(xì)胞，并提取細(xì)胞DNA，采用本試驗建立的方法對不同時間段的病毒含量進(jìn)行檢測。圖5A結(jié)果顯示，rHVT-CMV-pmpD和野生型HVT的增殖速度相近，感染48 h后時病毒含量出現(xiàn)明顯升高，感染后72 h～96 h為對數(shù)增長期，直到感染后120 h都在一直升高。同時，采用蝕斑法進(jìn)行檢測，圖5B結(jié)果表明，rHVT-CMV-pmpD和野生型HVT的增殖速度相近，48 h時開始有明顯升高，經(jīng)過72 h～96 h的對數(shù)增長期后，開始出現(xiàn)下降。

以1日齡SPF雞為動物模型，分別接種CEF細(xì)胞、rHVT-CMV-pmpD和野生型HVT后不同時間測定HVT的含量。圖6檢測結(jié)果表明，接種后3周才能檢測到HVT，直到第5周一直緩慢上升，但是二者各個時間段的病毒拷貝數(shù)沒有顯著性差異。

A.采用定量方法； B.采用蝕斑方法(*表示差異顯著)
A. Assay by real-time PCR; B. Assay by plaque (* Mean significant difference)

圖5 rHVT-pmpD-N和野生型HVT的體外一步生長曲線
Fig.5 One-step growth curves of rHVT-pmpD-N and parental HVTinvitro

圖6 rHVT-pmpD-N和野生型HVT的體內(nèi)一步生長曲線Fig.6 One-step growth curves of rHVT-pmpD-N and parental HVT in vivo

3 討論

Real-time PCR是在PCR擴(kuò)增過程中，通過引入熒光信號對PCR反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行實時檢測，已經(jīng)用于多種病毒的檢測，均取得了良好的效果[12-13]。根據(jù)real-time PCR化學(xué)發(fā)光原理可分為兩大類，一類為探針類，如TaqMan探針，其原理為通過與靶序列特異性雜交的探針指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加；另一類為非探針類，如SYBR Green Ⅰ，其原理為利用熒光染料來指示產(chǎn)物的增加。核酸探針特異性好，但是合成成本高、設(shè)計難度大，非核酸探針的染料對DNA的識別不具有特異性，非特異性產(chǎn)物如引物二聚體也可與之結(jié)合，從而影響定量的準(zhǔn)確性，但是可通過優(yōu)化反應(yīng)體系和引物設(shè)計的改變減少引物二聚體的出現(xiàn)。

HVT基因組為雙鏈DNA，G+C含量為47.5%。共包含有75個ORF，其中67個ORF 存在于包括MDV-1和MDV-2在內(nèi)的所有的α皰疹病毒中。sorf1基因為HVT所特有的，與編碼調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的Bcl家族中NR-13基因類似。因此,本試驗采用sorf1區(qū)基因序列進(jìn)行引物設(shè)計，進(jìn)行特異性擴(kuò)增，只能獲得HVT目的基因，而非MDV Ⅰ、Ⅱ基因，所以能夠特異性地檢測HVT及HVT載體疫苗。

本試驗建立的SYBR Green Ⅰ real-time PCR特異性好，靈敏度高，較標(biāo)準(zhǔn)PCR檢測提高1個數(shù)量級別。定量試驗中，只出現(xiàn)單一峰值，表明引物設(shè)計合理，并未出現(xiàn)染料的非特異性結(jié)合。通過條件優(yōu)化，最終獲得了較為理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線，循環(huán)閾值(Ct值)和標(biāo)準(zhǔn)陽性模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.99(理想值應(yīng)大于0.98，其值越接近1表明線性關(guān)系越好)，擴(kuò)增效率為81.7%(擴(kuò)增效率應(yīng)在0.8～1.2之間，以接近1為最佳)。并且具有良好的重復(fù)性和敏感性，可以用于后續(xù)的定量檢測。一步生長曲線表明，無論在體內(nèi)還是體外，構(gòu)建的rHVT-pmpD-N與野生型HVT相比，增殖速度沒有發(fā)生改變。

綜上所述，本試驗建立的基于SYBR Green Ⅰ 檢測HVT的real-time PCR方法，可實現(xiàn)體內(nèi)外定性和定量檢測HVT及重組HVT，靈敏度高、特異性好、操作簡便，對監(jiān)控HVT的體內(nèi)體外含量和增殖情況具有一定的實用價值。

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Establishment and Application of SYBR Green Ⅰ Real-time PCR Assays for Detecting HVT

LIU Shan-shan1,2,SUN Wei1,YAN Min-xin1,HUANG Xiu-fen1,JIANG Liang1,HE Cheng2,LI Yong-qing1

(1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,BeijingAcademyofAgriculturalandForestrySciences,Beijing,100097,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing,100193,China)

The purpose of this study was to develop a real-time PCR assay to detect and quantify herpesvirus of turkey(HVT)invivoandinvitrotargeting the unique sorf1 gene of the virus. This assay was carried out using a LingtCycler instrument and the product was monitored constinuously with the fluorescent double-stranded DNA binding dye SYBR Green Ⅰ. The duplicate character of wild HVT and recombinant HVT-pmpD-N(rHVT-pmpD-N)was detected using this method. Standard curve was established and the correlation index was 0.99. The result showed that SYBR Green Ⅰ real-time PCR had a minimum detection limit of 7×101copies/μL which was 10 times higher in sensitivity than standard PCR. SYBR Green Ⅰ real-time PCR assay also showed a similar replication rate between wild HVT and rHVT-pmpD-N. It was concluded that this could be an effective, economic and reliable method for rapid detection of wild HVT and recombinant HVT.

Herpesvirus of turkey;SYBR Green Ⅰ;real-time PCR;sorf1

2014-05-29

國家自然科學(xué)基金項目(31372420)；北京市科技計劃項目(Z121100001212001)

劉杉杉(1986-)，女，山東煙臺人，博士研究生，主要從事禽病疫苗和檢測方法的研究。*

S852.659.1;Q789

:A

:1007-5038(2015)02-0016-05