瑞舒伐他汀對(duì)急性心肌梗死患者行擇期PCI術(shù)后外周血TLR4表達(dá)及炎性因子的影響

路妍 張建華

瑞舒伐他汀對(duì)急性心肌梗死患者行擇期PCI術(shù)后外周血TLR4表達(dá)及炎性因子的影響

路妍 張建華

目的 觀察急性心肌梗死患者行擇期經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)術(shù)后外周血單核細(xì)胞Toll樣受體4(TLR4)表達(dá)變化，同時(shí)觀察瑞舒伐他汀強(qiáng)化治療對(duì)TLR4及炎性因子的影響。方法 選取急性心肌梗死患者90例為病例組。同期進(jìn)行健康體檢的正常人70例為對(duì)照。采用Real time-PCR和Western blot測(cè)定外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)。采用Gensini評(píng)分判定冠脈病變嚴(yán)重程度。病例組隨機(jī)分為治療A組和治療B組，每組45例，2組均接受常規(guī)治療，治療B組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上于PCI術(shù)前7 d給予口服瑞舒伐他汀10 mg/d。觀察2組術(shù)前、術(shù)后7 d左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)及hs-CRP、TNF-α、IL-6水平變化。結(jié)果 (1)對(duì)照組比較，病例組外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。且隨著冠脈病變嚴(yán)重程度增加，外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。相關(guān)性分析顯示，外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)與冠脈病變嚴(yán)重程度具有正相關(guān)性(P＜0.05)。(2)病例組治療后與術(shù)前比較，術(shù)后7 d治療A組和治療B組LVEF均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且治療B組顯著高于同期治療A組(P＜0.05)。術(shù)后7 d治療A組和治療B組LVESD、LVEDD、TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)、hs-CRP、TNF-α、IL-6水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，且治療B組顯著低于同期治療A組(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 急性心肌梗死患者行擇期PCI術(shù)前短期應(yīng)用瑞舒伐他汀能夠顯著改善心功能，其機(jī)制與抑制TLR4炎癥信號(hào)通路激活有關(guān)。

瑞舒伐他汀;急性心肌梗死;擇期;冠狀動(dòng)脈介入治療;Toll樣受體4

冠心病是嚴(yán)重影響中老年人群生命安全和生活質(zhì)量的常見心血管疾病之一，病死率和致殘率高，預(yù)后差［1］。近年來，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(PCI)已經(jīng)成為治療急性心肌梗死的首選治療手段。但是，PCI術(shù)后通過誘導(dǎo)局部炎性反應(yīng)導(dǎo)致心肌損傷及主要不良心血管事件發(fā)生，是患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［2，3］。研究顯示，Toll樣受體4(TLR4)炎癥信號(hào)通路激活后通過促進(jìn)核因子-κB(NF-κB)的激活和核轉(zhuǎn)位，上調(diào)hs-CRP、TNF-α、IL-6 等炎性因子的表達(dá)，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用［4］。然而，TLR4表達(dá)水平在急性心肌梗死發(fā)生發(fā)展和冠脈病變嚴(yán)重程度的關(guān)系及瑞舒伐他汀強(qiáng)化治療對(duì)其表達(dá)的影響目前報(bào)道尚少。本研究旨在觀察急性心肌梗死患者外周血單核細(xì)胞TLR4的表達(dá)變化及擇期PCI術(shù)前瑞舒伐他汀治療對(duì)TLR4表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年3月至2015年3月我院收治的急性心肌梗死患者90例為病例組，隨機(jī)分為治療A組和治療B組，每組45例。治療A組男25例，女20例;年齡35～70歲，平均年齡(58.85±8.67)歲;治療B組男28例，女17例;年齡33～72歲，平均年齡(59.21±8.90)歲。2組年齡、性別比、原發(fā)疾病、Killip分級(jí)、梗死部位等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，具有可比性。見表1。

表1 2組一般資料比較 n=45

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)心肌缺血引起的胸痛癥狀持續(xù)時(shí)間超過30 min;(2)心電圖具有典型的動(dòng)態(tài)變化，即至少2個(gè)以上相鄰導(dǎo)聯(lián)ST段抬高;(3)血清心肌壞死標(biāo)志物肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白I(cTnI)等水平升高超過正常者2倍以上;(4)發(fā)病持續(xù)時(shí)間超過1 d，不符合急診PCI指征;(5)所有患者均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并心、肝、肺、腎等重要臟器功能不全者;(2)凝血功能障礙患者;(3)自身免疫性疾病、腦卒中、惡性腫瘤患者;(4)有他汀類藥物過敏史者。

1.3 治療方法 治療A組和治療B組均給予腸溶阿司匹林抗凝、β受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、氯吡格雷等常規(guī)治療。治療B組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上術(shù)前7 d口服瑞舒伐他汀(舒夫坦，南京先聲東元制藥有限公司)10 mg/d，1次/d，睡前服用。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 Real time-PCR:根據(jù)GeneBank中人TLR4 mRNA序列，采用Primer軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生物工程有限公司合成。Trizol提取外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度和濃度。以總RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，合成cDNA第1鏈。PCR反應(yīng)在ABI 7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增完畢后進(jìn)入儀器自帶的SDS v1.3軟件結(jié)果分析界面，使用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)計(jì)算樣品間Ct值。設(shè)對(duì)照組樣品為標(biāo)準(zhǔn)1，目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平為2-△△Ct，設(shè)β-actin為內(nèi)參照基因。見表2。

表2 Real time-PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.4.2 Western blot:外周血單個(gè)核細(xì)胞加入RIPA裂解液200 μl，冰上放置30 min充分裂解細(xì)胞。提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量蛋白，每組取100 μg總蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，將目的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，10%脫脂奶粉室溫震蕩封閉2 h。加入特異性一抗孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色、定影。

1.4.3 ELISA法:分別于PCI術(shù)治療前后抽取患者清晨空腹靜脈血2 ml，3 000 r/min離心10 min，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。采?ELISA法測(cè)定血清 hs-CRP、TNF-α、IL-6水平，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。960酶標(biāo)儀購自美國(guó)Sigma公司。

1.4.4 心功能檢測(cè):采用高分辨率彩色多普勒超聲診斷儀(美國(guó)PHILIPS公司)觀察心功能相關(guān)指標(biāo)，包括左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組和病例組外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，病例組外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見表3。

2.2 不同病變支數(shù)病例組患者外周血單核細(xì)胞TLR4mRNA和蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，隨著病變支數(shù)的增加，病例組患者外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)逐漸升高，兩兩相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表4。

表3 對(duì)照組和急性心肌梗死患者組外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)比較±s

表3 對(duì)照組和急性心肌梗死患者組外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)比較±s

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別 TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)水平對(duì)照組(n=70)0.78±0.12 0.57±0.09病例組(n=90) 4.99±0.74* 4.68±0.65*

表4 不同病變支數(shù)病例組患者外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)比較±s

表4 不同病變支數(shù)病例組患者外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)比較±s

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與1支病變比較，#P ＜0.05;與2支病變比較，△P ＜0.05

組別 TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)水平對(duì)照組(n=70)0.78±0.12 0.57±0.09病例組1支病變(n=36) 3.46±0.53* 3.28±0.49*2支病變(n=33) 4.77±0.71*# 4.46±0.63*#3支病變(n=21) 5.64±0.82＊△ 5.38±0.77＊△

2.3 病例組患者外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)與冠脈病變嚴(yán)重程度的關(guān)系 Sperman相關(guān)分析結(jié)果顯示，病例組患者外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)與冠脈病變支數(shù)呈正相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.4 病例組治療前后心功能比較 術(shù)前治療A組和治療B組LVEF、LVESD、LVEDD比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。術(shù)后7 d 2組LVEF均較術(shù)前顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且治療B組顯著高于同期治療A組(P＜0.05);術(shù)后7 d 2組LVESD、LVEDD均較術(shù)前顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且治療B組顯著低于同期治療A組(P＜0.05)。見表5。

表5 病例組治療前后心功能比較n=45，±s

表5 病例組治療前后心功能比較n=45，±s

注:與術(shù)前比較，*P＜0.05;與治療A組比較，#P ＜0.05

組別 LVEF(%) LVESD(mm) LVEDD(mm)治療A組術(shù)前 31.78±4.53 52.89±6.33 69.31±7.65術(shù)后7 d 36.89±5.05* 49.92±5.35* 63.29±6.40*治療B組術(shù)前 32.12±4.67 53.02±6.42 69.12±7.58術(shù)后7 d 40.11±6.23*# 45.06±4.23*# 57.21±6.23*#

2.5 病例組治療前后TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)比較

術(shù)前治療A組和治療B組TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);術(shù)后7 d 2組TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)均較術(shù)前顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且治療B組顯著低于同期治療A組(P ＜0.05)。見表6。

表6 病例組治療后TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)比較n=45，±s

表6 病例組治療后TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)比較n=45，±s

注:與術(shù)前比較，*P ＜0.05;與治療A組比較，#P ＜0.05

組別 TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平 TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)水平治療A組術(shù)前 4.95±0.70 4.62±0.62術(shù)后7 d 3.52±0.49* 3.31±0.36*治療B組術(shù)前 5.04±0.78 4.72±0.69術(shù)后7 d 2.68±0.42*# 2.47±0.33*#

2.6 病例組治療前后炎性因子比較 術(shù)前治療A組和治療B組hs-CRP、TNF-α、IL-6比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。術(shù)后7 d 2 組 hs-CRP、TNF-α、IL-6 均較術(shù)前顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且治療B組顯著低于同期治療A組(P＜0.05)。見表7。

表7 病例組治療前后炎性因子比較n=45，±s

表7 病例組治療前后炎性因子比較n=45，±s

注:與術(shù)前比較，*P ＜0.05;與治療A組比較，#P ＜0.05

組別 hs-CRP(mg/L) TNF-α(ng/L) IL-6(pg/L)治療A組術(shù)前 34.15±5.23 278.56±17.29 43.65±5.34術(shù)后7 d 21.33±3.24* 157.43±11.43* 26.77±4.12*治療B組術(shù)前 32.87±5.02 282.34±19.32 41.38±5.12術(shù)后7 d 10.42±1.46*# 54.16±7.45*# 13.34±2.02*#

3 討論

研究顯示，TLR4炎癥信號(hào)通路的激活在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用［5］。TLR4信號(hào)通路通過MyD88依賴性和MyD88非依賴性途徑促進(jìn)NF-κB 的活化和核轉(zhuǎn)位，從而上調(diào) hs-CRP、TNF-α、IL-6等炎性因子的表達(dá)和釋放，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定性增加及冠心病的發(fā)生發(fā)展［4］。hs-CRP是機(jī)體炎性反應(yīng)的敏感性標(biāo)志物，能夠促進(jìn)TNF-α、IL-6表達(dá)，與炎癥程度、不良心血管事件發(fā)生及預(yù)后呈正相關(guān)［6］。TNF-α是主要有活化巨噬細(xì)胞分泌的促炎因子，能夠抑制心肌收縮力、激活并誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞在組織的積聚，從而加重局部炎性反應(yīng)［7］。IL-6是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌的關(guān)鍵促炎因子，具有促進(jìn)斑塊形成的作用并導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定性增加。基礎(chǔ)和臨床研究證實(shí)，急性心肌梗死患者尤其是合并不良心血管事件的患者外周血和不穩(wěn)定斑塊中TLR4、TNF-α、IL-6等促炎因子水平顯著升高，預(yù)示患者預(yù)后不良［8，9］。本研究結(jié)果顯示，病例組患者外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)較健康對(duì)照組顯著升高，且其表達(dá)與冠脈病變嚴(yán)重程度具有正相關(guān)性(P ＜0.05)，與前人報(bào)道［10］一致，說明急性心肌梗死患者外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)與主要心血管不良事件發(fā)生及患者預(yù)后密切相關(guān)。

臨床研究證實(shí)，術(shù)前強(qiáng)化瑞舒伐他汀治療對(duì)PCI術(shù)后心肌損傷具有明顯保護(hù)作用，能夠明顯降低心血管事件發(fā)生率，但其具體機(jī)制尚不清楚［11］。本研究結(jié)果顯示，病例組經(jīng)治療后，治療B組PCI術(shù)后LVEF顯著高于治療 A組，LVESD、LVEDD、TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)、hs-CRP、TNF-α、IL-6顯著低于治療 A 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明PCI術(shù)前強(qiáng)化瑞舒伐他汀治療可能通過下調(diào)TLR4表達(dá)抑制炎性反應(yīng)，穩(wěn)定粥樣斑塊并減少不良心血管事件發(fā)生。

綜上所述，急性心肌梗死患者外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)顯著升高，且與冠脈病變嚴(yán)重程度密切相關(guān)。PCI術(shù)前強(qiáng)化瑞舒伐他汀治療能夠明顯改善患者心功能，其機(jī)制與下調(diào)外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)，進(jìn)而抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。

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Effects of rosuvastatin on Toll-like receptor 4 expression in peripheral blood monouclear cell and on inflammatory factor in patients with acute myocardial infarction after selective percutaneous coronary intervention

LU Yan，ZHANG Jianhua．Department of Internal Medicine，Gneral Hospital of Jizhong Energy Sources Fengfeng Group，Hebei，Handan 056002，China

Objective To observe the change of Toll-like receptor 4(TLR4)in acute myocardial infarction(AMI)patients undergoing selective percutaneous coronary intervention(PCI)and to investigate the effects of rosuvastatin on Toll-like receptor 4 expression in peripheral blood monouclear cell and on inflammatory factor.Methods A total of 90 patients with AMI treated by PCI were enrolled in the study.Meanwhile 70 healthy subjects were served as control group.Real time-PCR and Western Blot were used to detect the expression levels of TLR4 mRNA and protein.Gensini score was used to evaluate the severity of coronary artery lesions.The 90 patients were randomly divided into two groups:group A and group B，with 45 patients in each group.The patients in both groups

routine therapy，however，the patients in group B，on the basis of routine therapy，were given orally rosuvastatin(10mg/d)on 7 days before PCI.The changes of LVEF，LVESD，LVEDD，TLR4 mRNA and protein，hs-CRP，TNF-α，IL-6 were detected before surgery and on 7d after surgery.Results As compared with those in control group，the expression levels of TLR4 mRNA and protein were significantly increased in patients with AMI(P ＜0.05).Moreover the expression levels of TLR4 mRNA and protein were gradually increased，with the increasing of severity of coronary lesions(P＜0.05).The correlation analysis showed that the expression levels of TLR4 mRNA and protein were positively correlated to the severity of coronary lesions(P＜0.05).As compared with that before therapy，LVEF in both treatemt groups were significantly increased on 7d after PCI(P ＜0.05)，furthermore，LVEF in group B was significantly higher than that in group A(P ＜0.05).The levels of LVESD，LVEDD，TLR4 mRNA and protein，hs-CRP，TNF-α，IL-6 in both treatment groups were significantly decereased on 7d after PCI，as compared with those before surgery(P ＜0.05)，moreover，which in group B were significantly lower than those in group A(P ＜0.05).Conclusion The short-term application of rosuvastatin before elective PCI surgery in patients with AMI can obviously improve patient’s cardiac function，and its action mechanism may be related with inhibiting the activation of TLR4 signal transduction pathway.

rosuvastatin;acute myocardial infarction;selective period;percutaneous coronary intervention therapy;Toll-like receptor 4

R 542.22

A

1002-7386(2015)23-3544-04

10．3969/j．issn．1002-7386．2015．23．007

056002 河北省邯鄲市，冀中能源峰峰集團(tuán)總醫(yī)院邯鄲院區(qū)內(nèi)科

2015-07-20)