硫辛酸對糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用

劉潔 王紅杰 侯明輝 張晶 張海松

硫辛酸對糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用

劉潔 王紅杰 侯明輝 張晶 張海松

目的 探討硫辛酸對糖尿病腎病(DN)大鼠足細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。方法 制備糖尿病腎病(DN)大鼠模型，成模后隨機(jī)選取10只作為DN組(B組)，10只作為硫辛酸干預(yù)組(C組)，并設(shè)立正常對照組(A組)。實(shí)驗(yàn)共13周，于第13周末收集各組大鼠腎組織標(biāo)本，分別應(yīng)用硫代巴比妥酸(TAB)法、黃嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法測定腎臟中MDA含量和T-SOD、GSH-PX活性，應(yīng)用western blot、免疫組化測定nephrin、podocin的表達(dá)。結(jié)果 DN組大鼠腎組織中MDA含量較A組明顯升高，T-SOD、GSH-PX活性及nephrin、podocin的表達(dá)較A組明顯下降(P＜0.05)，而硫辛酸C組大鼠腎組織中MDA含量較DN組明顯下降，T-SOD、GSH-PX活性及nephrin、podocin的表達(dá)較DN組明顯升高(P＜0.05)。結(jié)論 硫辛酸可通過抗氧化應(yīng)激作用抑制足細(xì)胞的凋亡，減少尿蛋白，延緩DN的發(fā)生發(fā)展。

硫辛酸;足細(xì)胞;糖尿病腎病;nephrin;podocin

近年來，氧化應(yīng)激在糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發(fā)病機(jī)制中的作用引起人們的廣泛關(guān)注［1］。研究表明氧化應(yīng)激可導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，加重DN 的發(fā)生、發(fā)展［2］。Nephrin、podocin正常表達(dá)于足細(xì)胞，是足細(xì)胞標(biāo)志蛋白之一，對維持腎小球正常結(jié)構(gòu)及濾過屏障起重要作用。α-硫辛酸(alpha-lipoic acid，ALA)是一種存在于線粒體的酵素，通過清除氧自由基、還原體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)、螯合金屬離子等發(fā)揮強(qiáng)抗氧化作用［3］，臨床上已被廣泛用于治療糖尿病相關(guān)并發(fā)癥，但有關(guān)其對糖尿病腎臟足細(xì)胞的保護(hù)作用的研究尚少。本研究通過構(gòu)建DN大鼠模型，探討硫辛酸對DN大鼠氧化應(yīng)激及足細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 2月齡健康雄性SD大鼠30只［河北大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號SCXX(京)2009-0004］，平均體重(246.38±6.32)g。普通飼料和高糖高脂飼料(普通飼料中添加10%豬油、2.5%膽固醇和20%蔗糖)均由河北大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。STZ購自Sigma公司，用前以0.1 mmol/L，pH值4.2的檸檬酸鹽緩沖液溶解，新鮮配成2%STZ溶液，經(jīng)濾菌器除菌，α-硫辛酸(美國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模及標(biāo)本收集:選取大鼠40只，經(jīng)單側(cè)腎切除后，隨機(jī)選取10只作為正常對照組(A組)，喂以普通飼料。其余30只大鼠作造模組，高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周，禁食12 h后左下腹腔注射STZ(30 mg/kg)。正常對照組注射等量檸檬酸鹽緩沖液。STZ注射1周后糖尿病造模組尾靜脈取血，以空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L或糖負(fù)荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L者為糖尿病造模成功鼠，繼續(xù)喂養(yǎng)4周，糖尿病大鼠以隨機(jī)血糖≥16.0 mmol/L，并出現(xiàn)微量白蛋白尿?yàn)镈N造模成功鼠，剔出因感染死亡和造模未成功的大鼠，入選DN造模成功鼠為20只，隨機(jī)分為DN組(B組)和硫辛酸組(C組)，每組10只。分別給予0.9%氯化鈉溶液和硫辛酸(50 mg·kg-1·d-1)1 ml腹腔注射4周。實(shí)驗(yàn)期間所有大鼠均自由飲水及進(jìn)食，不給予胰島素及其他任何降糖藥物。4周后用代謝籠收集24 h尿，用于測定尿蛋白(urine protein，UP)，記錄體重(body weight，BW);1%戊巴比妥鈉(5 ml/kg)腹膜腔注射麻醉成功后股動脈取血，分離血清，用于測定血糖(blood glucose，BG)和血肌酐(serum creatinine，Scr);切取右腎，濾紙吸干血跡后稱重，置于冰臺上，除掉被膜，取部分腎皮質(zhì)勻漿后測定丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性，取部分腎組織置于4%多聚甲醛(0.01 mol/L PBS配制)，固定48 h，用于免疫組化檢測及Masson染色，其余腎皮質(zhì)組織迅速置于液氮中按Western blot要求制備蛋白裂解液，-80℃保存。

1.2.2 血、尿生化指標(biāo)測定:每個樣本取20 μl血清和20 μl尿液用AU 2700型自動生化分析儀測定BG、Scr和UP。分別應(yīng)用硫代巴比妥酸(TAB)法、黃嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法測定腎組織中MDA含量和T-SOD、GSH-PX活性。

1.2.3 馬松染色:中性甲醛液固定組織，石蠟切片2 μm，常規(guī)脫蠟至水;Masson復(fù)合染色液5 min;0.2%醋酸水溶液稍洗;5%磷鎢酸5～10 min;0.2%醋酸水溶液浸洗2次(1 min×2次);亮綠染色液5 min，0.2%醋酸水洗2次;無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測大鼠腎組織中nephrin、podocin蛋白表達(dá):石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%雙氧水室溫避光孵育10 min;蒸餾水沖洗2次，各5 min;抗原修洗2次，各5 min;5 min后取出抗原修復(fù)盒，室溫自然冷卻，約 45 min;0.01 mol/L PBS沖洗 2次，每次5 min，滴加Ⅰ抗，4℃過夜;0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min，滴加Ⅱ抗復(fù)合體，37℃孵育30 min;0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min;DAB顯色;蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片，光鏡觀察，陽性部位呈棕黃色。免疫組化結(jié)果應(yīng)用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)采集圖像，并用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析。每張切片腎皮質(zhì)范圍內(nèi)隨機(jī)選取10個腎小球(400×)，計算單位面積陽性染色區(qū)域平均積分光密度(IOD)，以各組均值進(jìn)行比較。

1.2.5 Western印跡法檢測各組大鼠腎組織中nephrin、podocin蛋白表達(dá):每個樣品取 50 μg總蛋白，加6×SDS加樣緩沖液，在沸水中變性4 min，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜;5%脫脂奶粉37℃封閉PVDF膜1.5 h，參考Ⅰ抗的說明書，按照適當(dāng)比例用3%BSA稀釋Ⅰ抗，PVDF膜加入Ⅰ抗4℃孵育過夜，第2天PVDF膜放置在室溫30 min，再回收Ⅰ抗并用1×PBS洗滌PVDF膜。參考Ⅱ抗說明書孵育Ⅱ抗，應(yīng)用辣根過氧化物酶顯色，并照相保存。用美國UVP公司LabWorks 4.5軟件對Western條帶進(jìn)行定量分析，讀取積分光密度值(IOD)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，方差齊性檢驗(yàn)用Levene法，計量資料多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎重/體重、BG、腎功能的改變 第13周末，B組較A組大鼠腎重/體重增加，24 h UP定量明顯增加，BG、SCr水平明顯升高(P ＜0.05)，C組大鼠腎重/體重，SCr及24 h UP尿蛋白定量較B組明顯下降(P ＜0.05)，BG無明顯變化(P ＞0.05)。見表1。

表1 3組大鼠BG、腎重/體重、肌酐及尿蛋白的改變n=10，±s

表1 3組大鼠BG、腎重/體重、肌酐及尿蛋白的改變n=10，±s

注:與A組比較，*P ＜0.01;與B組比較，#P ＜0.05

組別 BG(mmol/L)KW/BW(mg/g)UP(mg/24 h) Scr(μmol/L)A組5.62±0.09 7.9±0.79 5.12±0.38 11.87±1.35 B組 29.04±1.49* 23.10±1.02* 24.92±1.20* 35.24±1.03*C組 24.31±1.98* 12.89±1.12# 13.59±1.31# 22.85±1.24#

2.2 3組大鼠腎皮質(zhì)丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)的變化 第13周末，B組腎皮質(zhì)中MDA的含量較A組大鼠明顯升高，而 GSH-Px、SOD活性較 A組大鼠明顯降低(P＜0.05)，C組大鼠腎皮質(zhì)中MDA的含量較B組大鼠明顯降低，而GSH-Px、SOD活性較B組大鼠明顯升高(P ＜0.05)。見表2。

2.3 腎臟形態(tài)學(xué)改變 與A組比較，13周時B組腎小球體積增大，系膜細(xì)胞增多，基底膜增厚，細(xì)胞外基質(zhì)增多，系膜區(qū)Masson綠染膠原纖維增多;而C組腎組織的病理改變較B組明顯減輕。見圖1。

表2 3組大鼠MDA、GSH-Px、SOD的變化n=10，±s

表2 3組大鼠MDA、GSH-Px、SOD的變化n=10，±s

注:與A組比較，*P ＜0.05;與B組比較，#P ＜0.05

組別 MDA(mmol/g·protein)T-SOD(103U/g·protein) GSH-PX(U)A組3.07±0.15 86.91±6.67 162.67±3.82 B組 12.51±1.16* 40.61±1.70* 85.14±3.25*C組 5.97±0.22# 70.58±4.11# 144.31±3.48#

圖1 3組大鼠腎組織Masson染色(Masson染色×400)

2.4 免疫組化檢測3組大鼠Nephrin、podocin的表達(dá)

與A組比較，B組Nephrin、podocin的表達(dá)明顯降低(P ＜0.05)，而C組與B組比較，Nephrin、podocin的表達(dá)明顯上升(P ＜0.05)。見表3，圖2。

表3 免疫組化檢測3組大鼠Nephrin、podocin的表達(dá)n=10，±s

表3 免疫組化檢測3組大鼠Nephrin、podocin的表達(dá)n=10，±s

注:與A組比較，*P ＜0.05;與B組比較，#P ＜0.05

組別Nephrin podocin A組179.51±13.61 127.40±10.02 B組 66.08±2.70* 52.89±2.73*C組 107.52±9.81# 96.16±5.53#

圖2 3組大鼠腎組織Nephrin、podocin的表達(dá)(免疫組化×400)

2.5 Western blot檢測3組大鼠Nephrin、podocin的表達(dá) 與A組比較，B組Nephrin、podocin的表達(dá)明顯降低(P ＜0.05)，而C組與 B組比較，Nephrin、podocin的表達(dá)明顯上升(P ＜0.05)。見表4，圖3。

表4 Western blot檢測3組大鼠Nephrin、podocin的表達(dá)n=10，±s

表4 Western blot檢測3組大鼠Nephrin、podocin的表達(dá)n=10，±s

注:與A組比較，*P ＜0.05;與B組比較，#P ＜0.05

組別Nephrin podocin A組1.087±0.041 1.203±0.015 B組 0.583±0.012* 0.677±0.011*C組 0.835±0.008# 0.983±0.015#

3 討論

圖3 3組大鼠腎組織Nephrin、podocin的表達(dá)(western blot)

高血糖引起的氧化應(yīng)激可通過多種途徑參與足細(xì)胞的損傷［4］:(1)激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，使足細(xì)胞肥大，促進(jìn)足細(xì)胞凋亡［5］;(2)引起糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)增多;(3)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)產(chǎn)生增多，TGF-β1可通過激活 p38MAPK和Caspase-3途徑引起足細(xì)胞凋亡［6］;(4)使PKC活化，通過激活核因子NF-κB，減少一氧化氮產(chǎn)生等多種途徑誘導(dǎo)活性氧簇(ROS)產(chǎn)生增多，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡。

腎小球足細(xì)胞是高度分化的終末期細(xì)胞，對維護(hù)腎臟濾過屏障的完整性有重要作用，其功能受損和數(shù)量減少在糖尿病患者蛋白尿形成和腎小球硬化過程中起著重要。足細(xì)胞分化蛋白nephrin、podocin正常表達(dá)于足細(xì)胞，是足細(xì)胞標(biāo)志蛋白之一，對維持腎小球正常結(jié)構(gòu)及濾過屏障起重要作用。Nephrin、podocin表達(dá)減少是導(dǎo)致 DN持續(xù)進(jìn)展的重要原因［7］。Susztak等［8］通過體外實(shí)驗(yàn)觀察到，ROS可直接攻擊腎小球足細(xì)胞，并激活足細(xì)胞還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶產(chǎn)生過多的ROS，從而形成惡性循環(huán)。本研究采用南京建成試劑盒分別應(yīng)用硫代巴比妥酸(TAB)法、黃嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法測定腎組織中MDA含量和T-SOD、GSH-PX活性。結(jié)果顯示，DN大鼠腎皮質(zhì)內(nèi)MDA含量明顯增多，SOD、GSH-Px活力明顯下降，足細(xì)胞分化蛋白nephrin、podocin表達(dá)明顯減少，大鼠24 h尿蛋白明顯增加，說明氧化應(yīng)激可使足細(xì)胞損傷，導(dǎo)致尿蛋白增加，腎小球硬化，從而促使糖尿病腎病形成和發(fā)展。

α-硫辛酸是一種目前在臨床廣泛應(yīng)用的強(qiáng)效抗氧化劑，可有效清除體內(nèi)氧自由基和活性氧，減輕機(jī)體OS狀態(tài)，提高機(jī)體抗氧化水平，抑制腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化及減輕足細(xì)胞損傷、基底膜增厚，減少尿蛋白排泄［9］等。張春陽等［10］研究發(fā)現(xiàn) α-硫辛酸能夠抑制氧化應(yīng)激所引起的核因子-κB信號通路的激活，從而減輕系膜細(xì)胞的增殖。ALA可通過抗氧化作用阻止糖尿病大鼠腎小球足細(xì)胞的凋亡，并且α-硫辛酸能降低DN患者血漿中還原型谷胱甘肽的水平，改善血管內(nèi)皮功能，從而延緩DN的進(jìn)展。本研究結(jié)果表明，C組大鼠 MDA含量較 B組明顯降低，而 SOD、GSH-Px活力明顯升高，Nephrin、podocin表達(dá)較B組增加，24 h尿蛋白明顯減少。表明硫辛酸可通過改善早期DN氧化應(yīng)激水平，減少足細(xì)胞的損傷和凋亡，減少尿蛋白的排泄，延緩DN進(jìn)展。

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Protective effect of the alpha-lipoic acid on oxidative stress in podocytes of rats with diabetic nephropathy

LIU Jie，WANG Hongjie，HOU Minghui，et al．Affiliated Hospital of Hebei University，Hebei，Baoding 071000，China

Objective To investigate the protective effect of alpha-lipoic acid(ALA)on oxidative stress in the podocytes of rats with diabetic nephropathy.Methods After the rat models with diabetic nephropathy were successfully established，the 10 rats were randomly selected as diabetic nephropathy group(group B)，the other 10 rats were regarded as ALA intervention group(group C)，at the sime time，10 normal rats were served as control group(group A).The animals were sacrificed at th end of 13 weeks，and the renal tissues specimens were harvested.The expression levels of nephrin and podocin were detected by Western Blot and immunohistochemistry.The contents of malondialdehyde(MDA)in renal tissues were measured by thiobarbituric acid(TAB)method and the activities of total superoxide dismutase(T-SOD)，glutathione peroxidase(GSH-PX)in renal tissues were detected by xanthine oxidase and dithio-2 nitrobenzoic acid method，respectively.Results As compared with those in group A，the concentrations of MDA in group B were significantly increased，however，the acticities of T-SOD ，GSH-PX and the expression levels of nephrin，podocin were significantly decreased(P ＜0.05).As compared with those in group B，the concentrations of MDA were obviously decereased，but the acticities of T-SOD ，GSH-PX and the expression levels of nephrin，podocin were significantly increased in group C(P ＜0.05).Conclusion ALA can inhibit the apoptosis of podocyte，reduce the urine protein and delay the pathogenesis and development of diabetic nephropathy through antioxidative stress effects.

alpha-lipoic acid;podocyte;diabetic nephropathy;nephrin;podocin

R 392.11

A

1002-7386(2015)23-3525-04

10．3969/j．issn．1002-7386．2015．23．001

項目來源:保定市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計劃項目(編號:11F07)

071000 河北省保定市，河北大學(xué)附屬醫(yī)院

張海松，071000 河北省保定市，河北大學(xué)附屬醫(yī)院;E-mail:hdfyzhs1665@sina.com

2015-05-05)