高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠脂肪細(xì)胞改變及平肥2號方干預(yù)的研究

劉威，劉霞，何軍鋒，3*，袁浩，吳莉峰，丁浩川，黃惠勇

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)湘杏學(xué)院，湖南 長沙 410208;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所，湖南 長沙 410208;3.湖南省瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 瀏陽 410300)

肥胖癥指體內(nèi)脂肪堆積過多和(或)分布異常、體質(zhì)量增加，是包括遺傳和環(huán)境因素在內(nèi)的多種因素相互作用所引起的慢性代謝性疾?。?］。無論是發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家，肥胖癥患病率都迅速上升，與多種疾病密切相關(guān)，可損害患者身心健康，成為重要的世界性健康問題之一。中醫(yī)認(rèn)為，肥胖癥多因過食肥甘厚味、缺乏運(yùn)動、先天稟賦等導(dǎo)致氣虛陽衰、痰濕瘀滯形成［2］。平肥2號方主要由澤瀉、茯苓、蒼術(shù)、藿香、枳實、法半夏、郁金、川芎等組成，具有健脾祛濕、行氣化痰的功效。本文以高脂飲食誘導(dǎo)的單純性肥胖大鼠為研究對象，探討平肥2號方對肥胖大鼠體質(zhì)量、脂肪細(xì)胞、肝臟及血糖血脂等的影響，為開發(fā)中藥復(fù)方的減肥功效提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料

SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量約100g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物批號:43004700011095(湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司)。低脂飼料(D12450B Rodent Diet with 10kcal%Fat)及高脂飼料(D12492 Rodent Dietwith 60kcal%Fat)均購置于美國Research Diet公司。

平肥2號方制備:在平肥方［3］的基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)整，由澤瀉12g，茯苓10g，蒼術(shù)15g，藿香10g，枳實15g，法半夏10g，郁金15g，川芎10g，決明子15g，山楂15g，熟地黃30g，炙甘草6g組成，均購置于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房，藥物水煎2次，混合過濾后濃縮為3.5g/ml的藥液，經(jīng)滅菌后儲存于4℃冰箱中備用，根據(jù)大鼠體質(zhì)量按1ml/100g計算出灌胃量。

奧利司他膠囊(0.12g/粒，重慶植恩藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20123131)按人的每日臨床用量360mg/d，劑量按體表面積等效劑量換算比率:360×0.018×5=32.4mg/(kg·d)。再根據(jù)大鼠體質(zhì)量按1ml/100g計算出灌胃量。

甘油三酯(TG)試劑盒(羅氏公司，批號603328-01);總膽固醇(TC)試劑盒(羅氏公司，批號604814-01);高密度脂蛋白(HDL)試劑盒(羅氏公司，批號R1:694014-01+R2:699598-01);低密度脂蛋白(LDL)試劑盒(羅氏公司，批號R1:689752-01+R2:682531-01);血糖(GLU)試劑盒(羅氏公司，批號601404-01)。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥

50只SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為低脂飼料組(10只)和高脂飼料組(40只)。每日上午9時記錄大鼠體質(zhì)量。控制室溫為20～22℃，濕度適宜，自由飲水，晝夜比12∶12。以高脂飼料組大鼠體質(zhì)量超過低脂組大鼠平均體質(zhì)量20%為成模標(biāo)準(zhǔn)。驗證成模后將成模的30只高脂飼料組大鼠分為模型組、奧利司他組、平肥2號方組。低脂組繼續(xù)予以低脂飼料喂養(yǎng)，其余各組繼續(xù)予以高脂飼料喂養(yǎng)。低脂組及模型組予蒸餾水灌胃，奧利司他組予奧利司他藥液灌胃，平肥2號方組予以平肥2號方藥液灌胃。連續(xù)4周。

2.2 動物處理

經(jīng)過4周的灌胃后各組大鼠取材。予10%水合氯醛腹腔麻醉，打開腹腔，腹主動脈采血，3000r/min離心，分離血清待測。取腎周脂肪、肝臟右外葉經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋、切片。

2.3 觀察指標(biāo)

應(yīng)用羅氏公司試劑盒檢測GLU、TG、TC、HDL、LDL;HE染色觀察脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞形態(tài)，光鏡下(單位像素:400×)觀察標(biāo)本并拍照。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，實驗結(jié)果所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，用單因素方差分析法，方差齊用LSD，不齊用Duntnett T3，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組治療期間體質(zhì)量變化

造模前各組大鼠體質(zhì)量無差異(P＞0.05)。經(jīng)過5周的喂養(yǎng)，高脂組有30只大鼠體質(zhì)量超過低脂組平均體質(zhì)量20%，將其隨機(jī)分為模型組、奧利司他組和平肥2號方組，每組10只。經(jīng)過4周的灌胃后，奧利司他組和平肥2號方組大鼠體質(zhì)量明顯低于模型組(P＜0.01)，但奧利司他組和平肥2號方組之間差異不明顯(P＞0.05)，表明平肥2號方和奧利司他均能有效控制大鼠體質(zhì)量，但兩者之間無顯著差異，見表1。

3.2 各組大鼠肝臟、脂肪細(xì)胞切片情況

低脂組大鼠脂肪細(xì)胞直徑小于模型組(P＜0.05)，奧利司他組及平肥方組亦低于模型組(P＜0.05)。見表2及圖1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化的情況(，n=10)

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化的情況(，n=10)

注:與低脂組對比，*P＜0.01;與模型組對比，#P＜0.01。

分組 造模前體質(zhì)量(g)造模后體質(zhì)量(g)治療后體質(zhì)量(g)治療期間體質(zhì)量變化(g)低脂組117.8±8.5 344.6±15.5 470.7±19.3 126.0±8.2模型組 121.6±7.3 440.5±25.8*655.4±14.3* 214.9±21.9*奧利司他組 122.0±6.6 413.2±28.3*540.0±35.0*#126.7±21.4#平肥2號方組 125.5±10.2 428.4±17.5*572.9±25.4*#144.5±24.4#

表2 各組大鼠脂肪細(xì)胞直徑情況(，n=10)

表2 各組大鼠脂肪細(xì)胞直徑情況(，n=10)

注:與低脂組對比，*P＜0.01;與模型組對比，#P＜0.01。

分組 脂肪細(xì)胞直徑(像素)低脂組193.98±11.13模型組 290.62±48.38*奧利司他組 246.82±23.78#平肥2號方組 228.96±10.68#

圖1 各組大鼠脂肪細(xì)胞切片

光鏡下，低脂組大鼠肝臟可見單個脂變肝細(xì)胞。模型組大鼠肝細(xì)胞體積增大，胞漿內(nèi)脂滴大小不一，脂變細(xì)胞達(dá)3/4以上，細(xì)胞水腫嚴(yán)重，灶性炎細(xì)胞浸潤。西藥組和針刺組較模型組脂變細(xì)胞在1/2以下，胞漿內(nèi)脂滴變小，輕度水腫，無炎細(xì)胞浸潤。如圖2。

3.3 各組大鼠血糖血脂情況

治療后各組大鼠TC、HDL、LDL、GLU無顯著差異，而低脂對照組的TG高于其他三組，見表3。

3.4 不良反應(yīng)觀察

奧利司他組大鼠大便溏稀不成形，活動減少，精神萎靡，毛色枯黃;模型組大鼠大便尚可，活動量稍減少，毛色略黃;平肥2號方組和低脂組大便正常，毛色有光澤。

表3 各組大鼠血清TC、TG、HDL、LDLC、GLU含量的情況(，n=10)

表3 各組大鼠血清TC、TG、HDL、LDLC、GLU含量的情況(，n=10)

注:與低脂組對比，*P＜0.01。

分組TC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL(mmol/L)LDL(mmol/L)GLU(mmol/L)低脂組 1.56±0.09 1.55±0.26 1.29±0.09 0.11±0.02 11.40±3.23模型組 1.42±0.18 0.76±0.18*1.39±0.26 0.09±0.03 13.80±1.25奧利司他組1.32±0.06 0.71±0.21*1.29±0.07 0.16±0.05 11.29±2.98平肥方2號方組(10)1.37±0.29 0.55±0.06*1.22±0.38 0.14±0.06 12.43±1.57

圖2 各組大鼠肝臟切片

4 討論

肥胖癥與糖尿病、高血壓、高血脂等疾病密切相關(guān)，已成為全球醫(yī)學(xué)關(guān)注的熱點。對于單純性肥胖癥的治療，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要有藥物療法、手術(shù)療法、運(yùn)動療法、飲食療法等，其中藥物治療是肥胖癥整體管理措施中十分重要的一個環(huán)節(jié)［4］。自從曲美等一批鹽酸西布曲明類藥物下架后，奧利司他是目前國內(nèi)僅有的合法減肥藥，它可抑制胃腸道消化脂肪所需的酵素，而減少胃腸道對脂肪的吸收，但其容易導(dǎo)致脂肪代謝紊亂，表現(xiàn)為胃腸脹氣、大便次數(shù)增多和脂肪便等［5］。在本實驗中，我們亦觀察到奧利司他組大鼠大便溏稀不成形、體毛枯黃，而平肥方組大鼠大便正常，毛色有光澤。因此，中醫(yī)藥治療肥胖癥的研究有著重要的現(xiàn)實意義。

中醫(yī)認(rèn)為肥胖癥多因過食肥甘厚味、缺乏運(yùn)動、先天稟賦等導(dǎo)致氣虛陽衰、痰濕瘀滯形成［2］。在臨床實踐的基礎(chǔ)上，我們對平肥方［3］進(jìn)行了改進(jìn)，制定了平肥2號方，它主要由澤瀉、茯苓、蒼術(shù)、藿香、枳實、法半夏、郁金、川芎、決明子、熟地黃、山楂、炙甘草組成，其中澤瀉、茯苓、蒼術(shù)、藿香健脾祛濕;郁金、川芎、枳實、法半夏行氣化痰;山楂、決明子消食通便;炙甘草調(diào)和諸藥。全方具有健脾祛濕，行氣化痰的功效。

在本實驗中，平肥2號方組和奧利司他組經(jīng)過4周的藥物治療后，體質(zhì)量和攝食量明顯低于模型組(P＜0.01)，治療期的體質(zhì)量增長亦低于模型組(P＜0.01)，表明奧利司他和平肥2號方均可有效抑制大鼠體質(zhì)量的增長。

脂肪細(xì)胞體積的增大，是肥胖病的重要組織學(xué)特征［6］。模型組大鼠脂肪細(xì)胞直徑比正常組增大，且差異顯著。提示模型組大鼠脂肪體積增大，這與人類肥胖癥的組織學(xué)改變是一致的。經(jīng)過4周的治療后，平肥2號方組和奧利司他組大鼠脂肪細(xì)胞直徑明顯變小，說明在藥物治療的作用下，整體的脂肪代謝經(jīng)調(diào)整后，脂肪組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了相應(yīng)的改變，可能是其減肥的重要形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。此外，平肥2號方組和奧利司他組大鼠肝臟病理切片可看出較模型組肝組織脂肪病變明顯減輕，提示兩組藥物皆可改善肝臟中脂質(zhì)的含量。

值得注意的是，本實驗中，低脂組甘油三酯高于模型組，可能與低脂飼料含有較高的碳水化合物(D12492:60%脂肪，20%碳水化合物;D12450B:10%脂肪，70%碳水化合物)有關(guān)。以非脂質(zhì)前體物質(zhì)(碳水化合物為主)為原料從頭合成脂肪酸，這也是合成TG的方式之一，主要發(fā)生在肝臟和脂肪組織。研究表明，高碳水化合物飲食刺激肝臟合成脂肪，而高脂飲食則起到抑制作用［7］。低脂飼料含有70%的碳水化合物，促進(jìn)了脂肪的合成，可能是我們的實驗出現(xiàn)低脂組TG高于模型組的原因。此外，有研究者認(rèn)為4周可能是肥胖大鼠模型的早期階段，此時脂肪組織內(nèi)蓄積較多脂肪，通過延長實驗時間，可能就會出現(xiàn)血清脂質(zhì)的升高［8］。因此，在本實驗中平肥方和奧利司他組大鼠血糖、血脂水平與模型組無顯著差異，可能與我們干預(yù)周期較短有關(guān)。

我們的實驗表明，平肥2號方和奧利司他都可有效抑制肥胖大鼠體質(zhì)量的增長，調(diào)整脂肪組織的形態(tài)，改善肝臟中脂質(zhì)的含量，但是奧利司他組大鼠出現(xiàn)大便溏稀，精神萎靡，毛色枯黃等副作用，而平肥2號方表現(xiàn)出較好減肥作用的同時，未出現(xiàn)其他毒副作用，大鼠各項狀況良好。因此，基于中醫(yī)理論所選擇的中藥復(fù)方平肥2號方在抗肥胖藥物研究中是極具優(yōu)勢的。當(dāng)然，其具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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