缺血后處理通過NMDA 受體對全腦缺血大鼠的神經保護作用

李 鑫，呂達平，姚 明，陳 欣

卒中是繼心臟病和癌癥后的全球第三大死因，并造成了全球性的健康威脅［1］。尋找新的治療手段顯得十分迫切，但是既往多個基于神經保護所進行的臨床試驗都沒有取得成功。缺血后處理是有助于減少缺血性損傷的一個方式，有望應用于臨床。

缺血后處理是指在器官缺血再灌注之前，給予一系列簡短而非致命性的缺血再灌注周期，可以對后續(xù)的長時間缺血損傷產生保護［2］。了解缺血后處理如何發(fā)揮神經保護作用十分必要，但其背后的分子機制尚不明確。

鈣-谷氨酸假說表明，缺血性損傷過程中過度釋放谷氨酸會導致神經毒性及細胞死亡，NMDA 型谷氨酸受體與缺血性神經損傷相關［3］?；谠摾碚?，通過阻斷NMDA 受體可以治療缺血性卒中，但NMDA 受體拮抗劑的臨床應用并不成功［4］。部分原因是因為有多個NMDA 受體亞型，并有不同的功能。門冬氨酸受體是由NR1、NR2、NR3 亞基組成的復合體，通常包括兩個NR1 和兩個NR2 亞基［5］。最近的研究表明，含有NR2A 和NR2B 受體的門冬氨酸受體在缺血性卒中中可能有不同的功能［6］。

我們假設NMDA 受體在缺血預處理中可能有重要作用，在本研究中，我們建立了大鼠的全腦缺血模型，發(fā)現激活NMDA 受體可以產生缺血后處理的保護作用，但并不是通過激活NR2B 來實現。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及動物分組 清潔級雌性SD大鼠30 只，體重180～220 g，將大鼠完全隨機分為假手術組(S 組)、全腦缺血15 min 再灌注組(I/R組)、全腦缺血后缺血后處理組(IP 組)、MK-801 預處理組(MK-801+IP)、ifenprodil 預處理組(ifenprodil+IP 組)，每組6 只。MK-801 預處理組缺血前2 h 腹腔注射MK-801(0.5 mg/kg)，ifenprodil 預處理組缺血前2 h 腹腔注射ifenprodil(10 mg/kg)。

1.2 大鼠全腦缺血再灌注模型的制作 本實驗采用改良的四血管阻斷法(4-VO)全腦缺血模型［7］。實驗動物于術前禁水禁食12 h 上，3.5%水合氯醛1 ml/100 g 腹腔內注射麻醉。將大鼠腹位固定于立體定位儀上，在頸部正中切開皮膚，逐層分離皮下組織，暴露翼孔，電凝針插入翼孔電灼，永久性灼斷兩側椎動脈。消毒后逐層縫合。24 h 后重新麻醉，背位固定，頸部正中切口切開皮膚，分離雙側頸總動脈，放置微動脈夾。模型成功判定標準為瞳孔放大，翻正反射消失。假手術組僅暴露第一頸椎和雙側頸總動脈，全腦缺血組夾閉雙側頸總動脈，15 min后再灌注;缺血后處理組于再灌注開始時連續(xù)3 次缺血/再灌注(15 s/15 s)。

1.3 Morris 水迷宮

1.3.1 水迷宮情況 保持環(huán)境安靜、黑暗。將水池分為4 個象限，平臺直徑約10 cm，位于第三象限正中。實驗開始前向水池注水至平臺上2 cm，加入墨汁使其不透明。實驗過程中平臺位置保持不變。迷宮上方置專用攝像機，與計算機連接。

1.3.2 隱藏平臺實驗 依次從4 個起始位置將大鼠面朝池壁放入水中，記錄大鼠游泳軌跡及爬上平臺所需時間，即逃避潛伏期。停留30 s 后進行下一位置訓練。如在記錄的120 s 內大鼠未能找到平臺，則協助大鼠找到平臺，并讓其在平臺上停留30 s 后進行下一位置試驗。每只大鼠每天于相同時間點進行訓練，連續(xù)訓練5 d。

1.3.3 空間探索實驗(probe test) 第6 天撤除平臺，開始探查訓練，將動物由平臺對側放入水中，記錄60 s 內動物在原平臺所在象限所花費的時間和穿過原平臺位置的次數。

1.4 曠場實驗(open-field test) 每日固定時間進行，曠場規(guī)格為0.8 m×0.8 m×0.5 m(長×寬×高)，底部被平分為25 個(16 cm ×16 cm)正方形區(qū)域，將大鼠置于中央區(qū)域中，觀察其3 min 內在中央格停留的時間、穿越的格子數、豎立次數及排便粒數。橫向穿越每格記為1 分，豎立(以雙上肢抬起為標準)每次為1 分，大便每粒記為1 分。每只動物測驗結束后以5%醋酸清潔曠場試驗箱。

1.5 神經功能缺損評分(neurologic deficit score，NDS) 參考Brambrink 等人的方法［8］，由不明分組情況的觀察人員在第1 天和第7 天對大鼠進行評價，評價標準包括意識、呼吸、反射、嗅覺、視力、運動、平衡能力、探索活動水平、對環(huán)境的反應及癲癇發(fā)作等。正常大鼠0 分，腦死亡大鼠100 分，所有評分均由觀察人員進行盲評。

1.6 標本采集 所有試驗結束后以3.5%水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉將大鼠重新麻醉，PBS 經心臟灌流至肝臟發(fā)白，再用4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦后置于多聚甲醛中固定48 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋。自前鹵點后3.5 mm 處冠狀切片，片厚5 μm。

1.7 Nissel 染色 將石蠟切片入二甲苯中脫蠟5～10 min，共3 次。無水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水2 min。切片置亞甲胺藍染液中56 ℃10 min，蒸餾水洗滌，95%乙醇分化至尼氏體清晰，無水乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片。光鏡下觀察，拍照。400 倍鏡下對各組大鼠腦片雙側海馬CA1進行觀察，記錄每250 μm 內的神經元數。每組選用6 只大鼠，每只大鼠隨機選擇5 張腦片進行統(tǒng)計。

2 結果

2.1 水迷宮測試結果 與I/R 組相比，IP 組大鼠的逃避潛伏期縮短，穿臺次數增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);與IP 組相比，MK-801 干預組逃避潛伏期增加，穿臺次數減少，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);ifenprodil 干預組逃避潛伏期及穿臺次數與IP 組無統(tǒng)計學差異(P ＞0.05)。以上結果提示缺血后處理在認知功能的保護上有明顯作用。而該保護作用可由NMDA 阻滯劑MK-801 所阻斷，選擇性阻滯NR2B 則對缺血后處理的保護作用沒有影響(見表1、表2，見圖1)。

2.2 曠場試驗 Open-field 評分測量發(fā)現，第1 天各組均無統(tǒng)計學差異，第7 天IP 大鼠較缺血組得分的水平較I/R 更低(P ＜0.05)。與IP 組相比，MK-801 干預組評分增加，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，ifenprodil 干預組評分與缺血后處理組無統(tǒng)計學差異(P ＞0.05)(見表3)。

2.3 神經功能缺損評分 神經功能缺損評分(NDS)分值提示IP 組功能缺損評分降低，與I/R 組差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。MK-801 干預組評分較IP組增加，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，ifenprodil 干預組評分與IP 組無明顯差異(P ＞0.05)(見表4)。

2.4 尼氏染色 尼氏染色鏡下觀察，對照組可見正常細胞膜，胞核呈淡藍色，細胞排列整齊，細胞形態(tài)無明顯變化，無細胞壞死。I/R 組細胞明顯腫脹淡染，胞核濃染，Nissl 小體溶解消失，細胞排列紊亂，細胞大量壞死。Ifenprodil 處理組與IP 組相比細胞水腫明顯減輕，壞死細胞數量明顯減少(見圖2)。MK-801 處理組與Ifenprodil 處理組相比細胞形態(tài)改善不明顯。對每250 μm 存活的神經元數進行統(tǒng)計，發(fā)現IP 組大鼠CA1區(qū)存活神經元較I/R 組有明顯增多(P ＜0.05)，MK-801 干預組存活神經元較IP組明顯減少(P ＜0.05)，ifenprodil 干預組神經元存活數與IP 組無明顯差異(P ＞0.05)(見表5)。

表1 各組大鼠逃避潛伏期(s，，n=6)

表1 各組大鼠逃避潛伏期(s，，n=6)

與I/R 組比較* P ＜0.05;與IP 組比較#P ＜0.05

表2 缺血后第7 天大鼠穿臺次數(，n=6)

表2 缺血后第7 天大鼠穿臺次數(，n=6)

與I/R 組比較* P ＜0.05;與IP 組比較#P ＜0.05

表3 各組大鼠開放野評分(，n=6)

表3 各組大鼠開放野評分(，n=6)

與I/R 組相比* P ＜0.05;與IP 組相比#P ＜0.05

表4 神經功能缺損評分(n=6)

表5 大鼠CA1區(qū)每250 μm 存活神經元數

圖1 各組大鼠穿臺次數(第7 天)

3 討論

圖2 不同組大鼠CA1區(qū)存活神經元數

本實驗采用了4 血管結扎法(4-VO)制作全腦缺血模型以評價認知功能。在腦組織中，與學習記憶相關的海馬對缺血損失最為敏感。本研究表明，在缺血后給予一系列非致死性的刺激可以產生神經保護作用，使神經元部分免于興奮性中毒或者氧化應激。這種保護作用不僅減少了缺血敏感區(qū)的神經元，也減少了大鼠的認知功能損傷和行為學異常。與既往在不同模型中的研究表現一致［9，10］。而進一步的研究表明，缺血后處理所產生的神經保護作用可以被NMDA受體抑制劑所阻斷，但當使用選擇性NR2B 抑制劑時，這種效應并沒有顯現。這些結果表明在缺血后處理中NMDA 受體起到了重要的作用，并提示激活NMDA受體的一個或多個亞型，可以產生缺血后處理的保護作用，但并不是通過激活NR2B 來實現的。

NMDAR 在中樞神經系統(tǒng)中分布廣泛，受體激活時鈣離子大量內流，使神經元興奮，并參與突觸可塑性和學習記憶等重要功能［11］。NR1 是基本亞基，NR2 是受體復合物的調節(jié)亞基，其中NR2A 表達以突觸為主，NR2B 的表達以突觸外為主。在正常大鼠中，上調NR2A 亞基的表達會損傷大鼠的空間記憶［12］，NR2B 過度表達的小鼠空間記憶能力明顯增強［13］。而在本研究中，非選擇性阻斷NMDA 亞基抵消了缺血后處理的保護作用，提示在腦缺血的早期，缺血后處理可能通過上調某一類型的NMDA 受體而起到保護作用。雖然NR2B 是與學習記憶最為密切的亞單位，且在既往的研究表明，選擇性阻斷NR2B亞基可以明顯減輕腦缺血后的腦損傷，但本研究中并未發(fā)現選擇性阻斷NR2B 與缺血后處理產生疊加作用。我們推測缺血后處理通過上調NR2A 亞基產生了神經保護作用。

大量的研究表明，NMDA 受體拮抗劑在保護缺血性神經元死亡時是有效的，但是在臨床試驗中NMDA 拮抗劑沒有收到預期結果。在缺血的早期，過度激活NMDA 受體會導致鈣離子大量內流而產生鈣超載，并觸發(fā)細胞死亡。但在缺血的整個過程中，谷氨酸受體的活性對于神經保護有重要的意義。缺血后處理作為一個內源性的保護機制，在臨床應用和基礎研究中都吸引了大量的注意，我們的研究表明，刺激某一類型的NMDA 受體使大腦在缺血中受到保護，這或許可以為尋找新的神經保護治療策略提供新的思路。

［1］Warlow C，Sudlow C，Dennis M，et al.Stroke［J］.Lancet，2003，362(9391):1211-1224.

［2］Zhao H，Sapolsky RM，Steinberg GK.Interrupting reperfusion as a stroke therapy:ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats［J］.J Cerebr Blood F Met，2006，26(9):1114-1121.

［3］Grabb MC，Choi DW.Ischemic tolerance in murine cortical cell culture:critical role for NMDA receptors［J］.J Neurosci，1999，19(5):1657-1662.

［4］Ikonomidou C，Turski L.Why did NMDA receptor antagonists fail clinical trials for stroke and traumatic brain injury［J］.Lancet Neurology，2002，1(6):383-386.

［5］Paoletti P，Neyton J.NMDA receptor subunits:function and pharmacology［J］.Current Opinion in Pharmacology，2007，7(1):39-47.

［6］Chen M，Lu TJ，Chen XJ，et al.Differential roles of NMDA receptor subtypes in ischemic neuronal cell death and ischemic tolerance［J］.Stroke:J Cerebral Circulation，2008，39(11):3042-3048.

［7］Pulsinelli WA，Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat［J］.Stroke，1979，10(3):267-272.

［8］Brambrink AM，Koerner IP，Diehl K，et al.The antibiotic erythromycin induces tolerance against transient global cerebral ischemia in rats(pharmacologic preconditioning)［J］.Anesthesiology，2006，104(6):1208-1215.

［9］李 鑫，秦新月，郭振委，等.缺血后處理對全腦缺血損傷后神經元結構可塑性及記憶的影響［J］.中華創(chuàng)傷雜志，2010，(8):757-760.

［10］胡躍強，唐 農，吳 林，等.缺血后處理對大鼠腦缺血再灌注損傷神經保護作用的研究［J］.中風與神經疾病雜志，2013，30(6):484-485.

［11］Ghafari M，Patil S S，Hoger H，et al.NMDA-complexes linked to spatial memory performance in the Barnes maze in CD1 mice［J］.Behavioural Brain Res，2011，221(1):142-148.

［12］Simoes PF，Silva AP，Pereira FC，et al.Methamphetamine induces alterations on hippocampal NMDA and AMPA receptor subunit levels and impairs spatial working memory［J］.Neuroscience，2007，150(2):433-441.

［13］White TL，Youngentob SL.The effect of NMDA-NR2B receptor subunit over-expression on olfactory memory task performance in the mouse［J］.Brain Research，2004，1021(1):1-7.