大鼠腦出血后活化星形膠質(zhì)細(xì)胞EGFR-JAK1/STAT3表達(dá)及Genistein 的抑制作用

肖 霖，劉 珍，武 衡

目前，許多研究認(rèn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞活化在腦出血后腦損傷中可能起著重要的作用，腦損傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過自分泌、旁分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)自身的分裂增殖，其中轉(zhuǎn)化生長因子-α(TNF-α)、表皮生長因子(EGF)是刺激活化AS 進(jìn)入細(xì)胞周期的關(guān)鍵因子［1］，而表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是TNF-α、EGF 兩種配體的共同受體。EGFR 是ErbB(ErbB1-4)家族的一員，是一種跨膜糖蛋白，屬受體型酪氨酸蛋白激酶(RTK)，與配體結(jié)合后，受體二聚化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酪氨酸蛋白激酶活化，通過激活下游多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK 通路、PI3K/PDK1/Akt 通路、JAK/STAT 通路)［2］將信息傳遞到核內(nèi)，作用靶基因，參與調(diào)節(jié)許多細(xì)胞的增殖、分化與遷移。近來有研究發(fā)現(xiàn)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷(外傷、卒中、腫瘤)或神經(jīng)系統(tǒng)變性(阿爾茨海默病、帕金森病)［3］等情況下，EGF 及EGFR 在星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)迅速上調(diào)，并長時(shí)間持續(xù)存在。我們最近的研究也表明，體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)用睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)活化后，EGFR mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)［4］，表明EGFR 可能介導(dǎo)了星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，是觸發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)的上游信號(hào)調(diào)控分子。而JAK/STAT 通路是EGFR 下游信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，基于此，我們選擇染料木黃酮(genistein，GST)特異地抑制酪氨酸激酶活性［5］，通過抑制EGFR 表達(dá)，進(jìn)一步抑制其下游信號(hào)系統(tǒng)的激活，從而抑制細(xì)胞生長，為腦損傷后干預(yù)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化提供新的藥效學(xué)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 體重200～300 g SD大鼠60 只(南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部購買)，雌雄各半。鼠腦立體定位儀;常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 大鼠腦出血模型制作 大鼠以10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定于鼠腦立體定位儀，參照鼠腦立體定位儀圖譜，確定進(jìn)針的部位:以前囟為原點(diǎn)，向后1.4 mm，矢狀縫右側(cè)旁開3.2 mm，開一約2 mm×2 mm 大小的正方形骨窗，通過微量注射器向下進(jìn)針5.6 mm，緩慢注入0.20 U/μl的Ⅶ型膠原酶2 μl。神經(jīng)功能評(píng)分采用Bederson 5 分制評(píng)分法:無神經(jīng)功能缺失癥狀0 分;提尾時(shí)損傷對(duì)側(cè)前肢屈曲1 分;前肢屈曲及對(duì)側(cè)抵抗推力下降2 分;向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈3 分;向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈及意識(shí)障礙4 分。1～3 分為造模成功大鼠。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 造模后大鼠隨機(jī)分為3 組(每組20 只)，腦出血模型組(ICH 組):造模后大鼠正常飼養(yǎng)，自由飲水;GST 組:造模后腹腔注射7.5 g/L 濃度Genistein(劑量50 mg/kg)，1 d 一次;DMSO 組:造模后每天腹腔注射相同劑量DMSO 溶液。每組大鼠分別于術(shù)后1 d、7 d、14 d 和28 d 4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行處理，各時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取5 只大鼠。

1.4 組織處理 大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打開胸腔，充分暴露心臟，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，用血管鉗鉗夾腹主動(dòng)脈，剪開右心耳，經(jīng)左心室快速灌入生理鹽水100～150 ml 左右，當(dāng)右心耳流出液變清亮?xí)r，再用4%多聚甲約200 ml 灌注固定，然后取腦組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中固體過夜后包埋成蠟塊，切片備用。

1.5 GFAP、EGFR 免疫組織化學(xué) 免疫組織化學(xué)采用SABC 法，對(duì)照組用PBS 代替一抗。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選擇5 個(gè)不同的視野，用Quantimet570 圖像分析系統(tǒng)Quic 圖像分析軟件進(jìn)行分析，測定陽性細(xì)胞的平均吸光度值(A 值)。

1.6 Western blot 法檢測p-JAK1 及p-STAT3提取各組腦組織總蛋白，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，10%脫脂奶粉封閉后，加入一抗、二抗孵育，最后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行底物顯色。使用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，以p-JAK1/p-STAT3 與βactin 灰度值的比值進(jìn)行比較分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，同一時(shí)間點(diǎn)組間及不同時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)的比較采用方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 3 組大鼠在腦出血術(shù)后1 d，神經(jīng)功能評(píng)分無明顯差異(P＞0.05);第7、14、28 天，GST 組與ICH 組、DMSO 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DMSO 組與ICH組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);GST 組的第7、14、28 天與第1 天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DMSO 組、ICH 組第7、14 天與第1 天比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);第28 天與第1 天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表1)。

2.2 各組大鼠GFAP、EGFR 表達(dá)的比較 腦出血后第1、7，14、28 天均可見GFAP、EGFR 陽性表達(dá)，腦出血后第1、7 天，ICH 組、DMSO 組及GST 組GFAP、EGFR 陽性表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)，第14、28 天，GST 組GFAP、EGFR 陽性細(xì)胞明顯增多，與ICH 組、DMSO 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，各時(shí)間點(diǎn)DMSO 組陽性細(xì)胞表達(dá)與ICH 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見表2)。

2.3 各組p-JAK1、p-STAT3 蛋白表達(dá)水平比較 腦出血后，大鼠腦內(nèi)p-JAK1、p-STAT3 表達(dá)水平明顯上調(diào)，7 d 達(dá)高峰(見圖1)，14 d 開始下降，28 d仍有少量表達(dá)。第7 天GST 組p-JAK1、p-STAT3 水平較ICH 組、DMSO 組明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見圖2)，其余時(shí)間點(diǎn)，各組表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較(n=20，±s)

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較(n=20，±s)

與同時(shí)間點(diǎn)ICH、DMSO 組比較* P＜0.05;與同組1 d 比較#P＜0.05

表2 各組大鼠GFAP、EGFR 陽性表達(dá)平均吸光度值(A 值)比較(n=20，±s)

表2 各組大鼠GFAP、EGFR 陽性表達(dá)平均吸光度值(A 值)比較(n=20，±s)

與同時(shí)間點(diǎn)ICH、DMSO 組比較* P＞0.05;與同時(shí)間點(diǎn)ICH、DMSO 組比較#P＜0.05

圖1 各組第7 天p-JAK1、p-STAT3 蛋白表達(dá)

圖2 各組第7 天p-JAK1、p-STAT3 表達(dá)

3 討論

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元起結(jié)構(gòu)支持作用。正常情況下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞存在靜止態(tài)、活化態(tài)兩種并存細(xì)胞形態(tài)，但在病理?xiàng)l件下(出血、梗死、外傷等)，大量星形膠質(zhì)細(xì)胞在細(xì)胞因子作用下，從靜息狀態(tài)快速向活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化后，其在不同時(shí)期對(duì)腦損傷起著截然不同的作用，在病變?cè)缙?，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增殖過程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子與增殖細(xì)胞一起，將損傷區(qū)與非損傷區(qū)隔離，避免膠質(zhì)活化瀑布效應(yīng)造成進(jìn)一步的損傷［6］。但在星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增殖晚期，早期的多種有益功能逐漸消失，反而分泌許多有害因子，形成化學(xué)屏障，影響神經(jīng)再生，同時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞過度增生形成的膠質(zhì)瘢痕可形成機(jī)械性屏障，阻礙軸突的再生、延長和融合［7］，并且膠質(zhì)瘢痕可以形成微血管套，壓迫微血管，影響局部的血液供應(yīng)。因此，探討星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化機(jī)制、功能及調(diào)控因素，對(duì)于調(diào)控腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少膠質(zhì)瘢痕的形成，促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)具有重要的意義。

腦損傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化是損傷刺激通過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，由細(xì)胞外通過細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)傳遞到細(xì)胞核，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控信號(hào)通路相關(guān)蛋白(如細(xì)胞周期蛋白cyclinsD1)等表達(dá)增高，從而啟動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程，促使細(xì)胞由G1 期向S 期轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞不斷增殖活化，到后期形成膠質(zhì)瘢痕，影響神經(jīng)功能的恢復(fù)［7］。研究表明，大鼠腦缺血后，活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中存在EGFR 表達(dá)上調(diào)，而且隨著時(shí)間的遞進(jìn)其陽性表達(dá)值迅速上調(diào)，阻斷EGFR 的表達(dá)可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，達(dá)到保護(hù)缺血性腦損傷作用，表明EGFR 可能是腦損傷后促進(jìn)星型膠質(zhì)細(xì)胞的活化重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后第7天，腦組織中出現(xiàn)明顯的EGFR 陽性表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞，第14、28 天仍可見EGFR 陽性表達(dá)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，EGFR 陽性表達(dá)與GFAP 陽性表達(dá)值成正相關(guān)性變化，予以GST 阻斷EGFR 表達(dá)后，能明顯抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，表明EGFR 參與了腦出血后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化進(jìn)程。

那么EGFR 是通過何種下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化的呢?目前，EGFR-JAK/STAT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與腫瘤細(xì)胞的增生關(guān)系已經(jīng)明確，那么，我們是否可借鑒而用于研究其是否與星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖有關(guān)呢?目前尚無此方面的研究。不過，近來已有許多研究表明JAK 及STAT 家族成員在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和損傷修復(fù)過程中存在不同程度的表達(dá)［8］。JAK/STAT 信號(hào)傳導(dǎo)途徑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究，以往主要集中在神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)領(lǐng)域，與膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系是最近才為人們所認(rèn)識(shí)，而且主要集中在小膠質(zhì)細(xì)胞，如腦缺血可使小膠質(zhì)細(xì)胞的JAK/STAT 信號(hào)傳導(dǎo)途徑活化，在星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、增殖中的作用目前不清楚。JAK-STAT 途徑主要是各種細(xì)胞因子與受體結(jié)合，使其二聚體化，JAK 相互靠近、磷酸化，使受體上的酪氨酸殘基磷酸化，通過STAT 形成二聚體后，STAT 與受體分離，轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，結(jié)合到DNA 序列，從而調(diào)控基因表達(dá)。目前，已知AS 上有眾多細(xì)胞因子(如IL-1、IL-6、EGF、TNF-α等)的靶點(diǎn)，所以，我們推測當(dāng)這些細(xì)胞因子與AS 上的受體結(jié)合后，可激活JAK/STAT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而STAT3 在GFAP 啟動(dòng)子上有結(jié)合位點(diǎn)，激活后進(jìn)入核內(nèi)與其位點(diǎn)結(jié)合，引起酪氨酸的快速磷酸化和AS中STAT-3 的核轉(zhuǎn)位，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化增生［9］。本實(shí)驗(yàn)顯示，腦出血后星形膠質(zhì)細(xì)胞中EGFR 表達(dá)上調(diào)，p-JAK1、p-STAT3 蛋白表達(dá)水平也上調(diào)，代表星形膠質(zhì)細(xì)胞的應(yīng)激性反應(yīng)的GFAP 表達(dá)值也相應(yīng)上調(diào)，表明腦出血后，活化的EGFR 經(jīng)下游信號(hào)JAK1/STAT3 通路，誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞過度增殖，從而發(fā)揮其對(duì)神經(jīng)功能的損傷作用。在給予EGFR 阻斷劑干預(yù)后，GFAP表達(dá)值、p-JAK1、p-STAT3 蛋白水平均受到抑制，神經(jīng)功能恢復(fù)，由此提示EGFR-JAK1/STAT3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在大鼠腦出血后星形膠質(zhì)細(xì)胞化中發(fā)揮重要作用。

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