孕期大鼠急性胰腺炎病因及病理變化的相關研究

張　旋，劉　毅，李　斌，柯麗娜，王瑩利，黃亞雄

(湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院 a.婦產科,b.泌尿外科,湖北 十堰 442008)

孕期大鼠急性胰腺炎病因及病理變化的相關研究

張旋a，劉毅b※，李斌a，柯麗娜a，王瑩利a，黃亞雄a

(湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院 a.婦產科,b.泌尿外科,湖北 十堰 442008)

摘要：目的探討孕期大鼠急性胰腺炎病因及病理變化的相關情況。方法選擇2013年2月至2015年1月由湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院實驗動物中心提供的健康性成熟SD雌性大鼠48只，雄性大鼠24只，按雌雄比2∶1合籠進行交配，發(fā)現(xiàn)有陰道栓后記為孕期第1日，根據(jù)隨機數(shù)字表法分為實驗組和對照組，各24只。對照組孕后繼續(xù)進行自由喂養(yǎng)，而實驗組在孕期第7日建立急性胰腺炎模型。實驗組在造模后6、12、24 h(對照組在相應時間點)進行肺濕重系數(shù)測定、肺組織的組織學評分、肺組織細胞凋亡測定及肺組織Bax和Bcl-2 mRNA測定，并進行相關性分析。結果病理學檢查發(fā)現(xiàn)，與對照組相比實驗組的胰腺組織壞死明顯，大量炎性細胞浸潤，造模獲得成功。實驗組造模后相應時間點的肺濕重系數(shù)、肺損傷病理評分較對照組均顯著升高(P<0.01)。對照組肺組織僅見少量細胞凋亡，實驗組肺組織細胞凋亡指數(shù)較對照組顯著增加(P<0.01)。對照組的Bax和Bcl-2 mRNA表達均較弱，而實驗組的Bax和Bcl-2 mRNA表達較對照組各時點均顯著增強(P<0.01)。在實驗組中，Pearson相關分析顯示肺損傷病理學評分、肺濕重系數(shù)與肺組織細胞凋亡指數(shù)均呈正相關(P<0.05)。結論孕期大鼠急性胰腺炎可導致肺損傷的發(fā)生、發(fā)展，而Bcl-2、Bax基因表達的改變參與了孕期大鼠急性胰腺炎肺損傷，可能是促進肺組織細胞凋亡的重要因素。

關鍵詞：急性胰腺炎；妊娠；病理；肺損傷；大鼠

急性胰腺炎是比較常見的急腹癥之一，其中重癥急性胰腺炎的病死率為20.0%左右[1]。妊娠合并急性胰腺炎并不多見，但近年來有增多的趨勢，具有發(fā)病急、病死率高的特點，母親的病死率可高達30.0%左右，胎兒的病死率為15.0%左右[2]。業(yè)已證實,急性胰腺炎時急性肺損傷的發(fā)生率可高達65.0%左右，終致繼發(fā)急性呼吸窘迫綜合征達20.0%左右，是急性胰腺炎患者死亡的主要原因之一[3-4]。目前急性胰腺炎肺損傷的發(fā)生機制仍不完全清楚，在臨床治療上也頗為棘手，因此對孕期大鼠急性胰腺炎病因及病理變化的研究仍是醫(yī)學領域研究的熱點[5]。初步研究表明，當發(fā)生急性胰腺炎時大量產生的內毒素和細胞因子可通過促進肺血管內皮細胞凋亡，加重肺血管內皮、肺泡上皮損傷而參與急性肺損傷的炎癥反應過程[6-7]。而Bax基因與Bcl-2基因均是凋亡調控基因Bcl-2家族成員，其中Bax過度表達可促進細胞的凋亡，而Bcl-2表達增多能阻遏細胞凋亡[8]。本研究通過制備孕期大鼠急性胰腺炎，研究不同時間點肺與胰腺病理損害情況，檢測Bax與Bcl-2表達情況，以探討孕期大鼠急性胰腺炎病因及病理變化的相關情況，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1實驗動物與試劑選擇2013年2月至2015年1月由湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院實驗動物中心提供的健康性成熟SD大鼠(合格證書：SCX2012-011)雌性清潔級48只(體質量180～220 g)。動物分籠飼養(yǎng)于標準動物房(22 ℃)，自由飲食，環(huán)境溫度、濕度適宜，給予規(guī)律光照(12 h∶12 h)。免疫組織化學染色試劑盒(SP9000系列)來自北京中杉金橋生物技術有限公司，Bax、Bcl-2與β-actin 的引物合成由大連TAKARA公司完成。

1.2 模型制備大鼠按雌雄比2∶1合籠進行交配，發(fā)現(xiàn)有陰道栓后記為孕期第1日，根據(jù)隨機數(shù)字表法分為實驗組和對照組，各24只。對照組孕后繼續(xù)進行自由喂養(yǎng)，而實驗組在孕期第7日建立急性胰腺炎模型，大鼠在模型建立前12 h禁食，2%戊巴比妥鈉(上海新亞藥業(yè)有限公司生產，批號：1021724 )(0.25 mL/100 g)經(jīng)腹腔注射麻醉后常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，正中切口入腹由膽胰管以0.1 mL/min勻速逆行注入5%?；悄懰徕c(0.1 mL/100 g)，見胰腺出現(xiàn)壞死樣改變后逐層關腹。

1.3觀察指標肺濕重系數(shù)測定：在造模后6、12、24 h分別取大鼠左肺組織(每次取8只)，用電子天平稱濕重后，置90 ℃電熱干燥箱干燥1 h，72 h稱干重，肺濕重系數(shù)=(肺濕重-肺干重)/肺干重×100.0%。

肺組織的組織學評分：在造模后6、12、24 h也分別取大鼠的部分肺組織10%甲醛固定(每次取8只)，常規(guī)石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色(hematoxyin-eosin staining，HE)后在光鏡下觀察。肺組織的組織學評分參考[4]的評分標準，肺組織間質及腔內滲出物占據(jù)面積<15%為0分(正常)；15%～<25%為1分； 25%～<50%為2分； 50%～<75%為3分；75%～<100%為4分。

肺組織細胞凋亡測定：取上述時間點的部分肺組織，采用熒光素法測定，操作過程按試劑盒(上海生物工程有限公司生產，批號：109843)說明進行。二氨基聯(lián)苯胺顯色后蘇木精復染，在顯微鏡下觀察，同一切片高倍鏡下取3個不同視野，分取3次平均值計算凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100.0%。

肺組織Bax和Bcl-2 mRNA測定：取上述時間點的部分肺組織，總RNA的提取采用Trizol試劑提取方法，以β肌動蛋白為內參進行擴增，Bax和Bcl-2 mRNA表達水平以聚合酶鏈反應產物吸光度值/β肌動蛋白吸光度值的比值表示。

2結果

2.1病理形態(tài)學變化對比經(jīng)過觀察，相對于對照組，實驗組造模后6 h胰腺組織腫脹伴點狀出血點，12 h胰腺腫脹更加顯著，24 h大鼠胰腺組織結構模糊，胰周可見大量脂肪組織。光鏡下觀察造模后6 h胰腺充血水腫明顯，12 h胰腺水腫伴充血出血、胰腺實質大片凝固性壞死，24 h胰腺組織結構模糊，胰周見大量脂肪組織充填，表示造模成功。見圖1。

a、b. 正常大鼠胰腺組織(a：HE染色 ×100；b：HE染色×200)

c、d. 急性胰腺炎組織(c:HE染色 ×100；d：HE染色 ×200)

圖1大鼠正常胰腺和急性胰腺炎組織形態(tài)

2.2 兩組大鼠肺濕重系數(shù)、肺組織學評分與肺組織細胞凋亡指數(shù)比較實驗組造模后6、12、24 h的肺濕重系數(shù)、肺損傷病理評分較對照組顯著升高(P<0.01)，實驗組肺組織細胞凋亡指數(shù)顯著增加(P<0.01)。見表1。

表1　兩組大鼠肺濕重系數(shù)、肺損傷病理評分和凋亡指數(shù)比較　±s)

對照組：孕后自然喂養(yǎng)；實驗組：孕期第7日建立急性胰腺炎模型

2.3兩組大鼠Bax和Bcl-2 mRNA表達比較對照組Bax和Bcl-2mRNA表達均較弱，而實驗組的Bax和Bcl-2 mRNA表達較對照組各時點均顯著增強(P<0.01)。見表2。

表2兩組大鼠肺組織Bax和Bcl-2 mRNA表達比較

組別BaxmRNA造模后6h造模后12h造模后24hBcl-2mRNA造模后6h造模后12h造模后24h對照組0.42±0.050.47±0.060.43±0.030.47±0.040.45±0.050.47±0.04實驗組0.70±0.060.72±0.080.67±0.060.96±0.111.02±0.080.81±0.07t3.4873.6843.0925.8377.2236.488P<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

對照組：孕后自然喂養(yǎng)；實驗組：孕期第7日建立急性胰腺炎模型

2.4相關性分析在實驗組中，Pearson相關分析顯示肺損傷病理學評分、肺濕重系數(shù)與肺組織細胞凋亡指數(shù)均呈正相關(r=0.774,0.902,均P<0.05)。

3討論

急性胰腺炎是當前作為一種潛在的致命性疾病，其發(fā)病率逐年上升。其中約20.0%的患者臨床表現(xiàn)比較兇險，可發(fā)展為重癥急性胰腺炎，病死率高達30.0%左右[9]。急性胰腺炎早期即可出現(xiàn)全身炎癥反應綜合征，導致單個或多個臟器功能不全，肺是最常見受累器官，臨床上表現(xiàn)為急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征。孕期急性胰腺炎是急性胰腺炎的—個特殊類型，臨床并不多見，但其起病急，發(fā)展快，病程復雜，嚴重威脅母嬰健康，是妊娠合并外科急腹癥死亡的首位因素[10]。

孕期急性胰腺炎的病因目前尚未完全闡明，其主要因素為膽管疾患和飲酒，其他還有暴飲暴食、高鈣血癥、寄生蟲、損傷、高脂血癥等，此外一些腹部手術和藥物也可引起[11]。實驗研究表明，急性胰腺炎發(fā)生廣泛的胰腺腺泡細胞壞死，輕型急性胰腺炎則主要伴隨胰腺腺泡細胞凋亡而很少壞死[12]。本研究建立了孕期大鼠急性胰腺炎模型，通過病理學檢查發(fā)現(xiàn)，胰腺組織壞死明顯，大量炎性細胞浸潤，與人類急性胰腺炎改變極其相似，表明造模獲得成功。

肺損傷是一種肺泡毛細血管膜彌漫性損傷導致肺水腫和肺不張，臨床表現(xiàn)為呼吸窘迫和頑固性低氧血癥的綜合征。在急性胰腺炎中，胰腺的自身消化作用可引起胰腺結構的破壞并繼發(fā)漸進性的胰腺壞死，從而導致多器官損傷[13]。而多種細胞因子級聯(lián)反應介導胰腺炎性損傷并與消化酶、溶酶體酶相互作用、相互促進，最終產生嚴重的肺損傷。并且在胰腺炎發(fā)病過程中可產生過量的氧自由基，而過量的氧自由基可以引起微血管痙攣，損傷微血管內皮細胞，使毛細血管通透性增加，導致和加劇肺部組織損傷[14]。本研究結果顯示，實驗組造模后相應時間點的肺濕重系數(shù)、肺損傷病理評分較對照組均顯著升高(P<0.01)。對照組肺組織僅見少量細胞凋亡，實驗組肺組織凋亡細胞明顯增加。從機制上分析，急性胰腺炎時，胰酶異常激活造成胰腺細胞損傷，激活單核巨噬細胞，一方面加重胰腺損傷，另一方面引起肺損傷。并且發(fā)生急性胰腺炎時，中性粒細胞可大量積聚在肺組織內并與肺血管內皮細胞黏附，當被激活時可釋放多種有害物質，從而導致胰腺實質的損傷。同時在急性胰腺炎中，誘導凋亡可明顯減輕胰腺炎的病情，其中腺泡細胞的死亡方式?jīng)Q定了瀑布樣反應的程度，進而影響胰腺炎的病情輕重[15]。

在調控細胞凋亡的基因中，Bax、Bcl-2是Bcl-2家族中兩個比較重要的成員。在胰腺炎發(fā)生時Bax表達明顯增強，具有促進胰腺腺泡細胞凋亡的作用并且與胰腺炎病變程度呈負相關，而Bcl-2表達也增強，在胰腺炎發(fā)生時可能具有抑制導管上皮細胞凋亡，幫助胰腺炎后期組織修復、再生[16]。有學者在重癥急性胰腺炎大鼠中發(fā)現(xiàn)肺組織細胞Bax的表達隨病程的延長而漸增高，Bcl-2基因表達隨病程的延長而漸下降，認為Bcl-2、Bax基因表達參與了重癥急性胰腺炎肺損傷的發(fā)病機制[17]。本研究結果顯示，對照組的Bax和Bcl-2 mRNA表達均較弱，而實驗組的Bax和Bcl-2 mRNA表達較對照組各時點均明顯增強(P<0.01)，表明Bax表達增加能促進細胞凋亡，保護受損胰腺腺泡細胞；而Bcl-2基因為抑制細胞凋亡的一個重要調控基因，其表達水平增加可促進導管管狀復合體增生與修復。

急性胰腺炎的發(fā)病不僅局限于胰腺本身，還可累及全身，其中急性胰腺炎時大量釋放的內毒素和細胞因子可通過誘導肺血管內皮細胞損傷，導致通透性性肺水腫的產生[18]。本研究結果顯示，實驗組肺損傷病理學評分、肺濕重系數(shù)與肺組織細胞凋亡指數(shù)均呈正相關(P<0.05)，說明細胞凋亡不僅在生理狀態(tài)下對急性胰腺炎肺組織分化及衰老細胞的清除起重要作用，而且還參與急性胰腺炎肺損傷的發(fā)病過程。

總之，孕期大鼠急性胰腺炎可導致肺損傷的發(fā)生、發(fā)展，而Bcl-2、Bax基因表達的改變參與了孕期大鼠急性胰腺炎肺損傷，可能是促進肺組織細胞凋亡的重要因素。

參考文獻

[1]彭菊蘭,羅麗瓊,張桂麗,等.妊娠合并急性重癥胰腺炎兩例[J].中國計劃生育和婦產科,2015,12(3):73-74，76.

[2]戚偉珍,徐麗麗.22例高齡產婦并發(fā)急性胰腺炎患者的臨床分析[J].中國急救醫(yī)學,2015,35(1):78-81.

[3]王萍,高峰,王芳婷,等.雷公藤內酯醇對急性重癥胰腺炎大鼠全身炎癥反應肺損傷的影響[J].內蒙古中醫(yī)藥,2014,33(20):74-75.

[4]Paramanathan A,Walsh SZ,Zhou J,etal.Laparoscopic cholecystectomy in pregnancy: An Australian retrospective cohort study[J].Int J Surg,2015,9(18):220-223.

[5]劉營,呂文山,王孌,等.高甘油三酯血癥致妊娠期反復發(fā)生急性胰腺炎患者脂蛋白脂肪酶基因突變一例[J].中華內科雜志,2015,54(3):220-222.

[6]李晶,曹麗葉,張愛民,等.重癥急性胰腺炎肺損傷大鼠肺內血管生成素樣蛋白4、細胞間黏附分子-1基因表達及意義[J].臨床薈萃,2015,30(4):412-415.

[7]丁憲群,楊勝波,牛剛,等.丹參合參附注射液對重癥胰腺炎相關肺損傷保護作用的實驗研究[J].中國藥物經(jīng)濟學,2014,1(9):205-206.

[8]Belo SP,Magalh?esC,Freitas P,etal.Familial partial lipodystrophy,Dunnigan variety-challenges for patient care during pregnancy:a case report[J].BMC Res Notes,2015,8(1):140.

[9]劉曉,郭曉榕,張蓓蓓,等.自噬在大鼠急性壞死性胰腺炎時的變化及其意義[J].中華消化雜志,2015,35(1):39-43.

[10]羅乾坤,張宏偉,秦濤,等.微小RNA-19b對急性壞死性胰腺炎腺泡細胞壞死的作用[J].中華實驗外科雜志,2015,32(2):333-335.

[11]康新,梁正凱,路曉光,等.大黃附子湯對重癥急性胰腺炎腸黏膜上皮細胞線粒體超微結構和離子泵的影響[J].中華實驗外科雜志,2015,32(1):41-44.

[12]Nakao J,Ohba T,Takaishi K,etal.Omega-3 fatty acids for the treatment of hypertriglyceridemia during the second trimester[J].Nutrition,2015,31(2):409-412.

[13]殷濤,石喬,郭聞一,等.氫飽和生理鹽水在重癥急性胰腺炎肝損傷中的抗氧化應激作用及對絲裂原活化蛋白激酶通路的影響[J].中華實驗外科雜志,2015,32(1):33-36.

[14]曹麗葉,張愛民,程樹杰,等.重癥急性胰腺炎并發(fā)肺損傷大鼠的生存素基因表達及對血紅素加氧酶1及細胞凋亡的影響[J].臨床薈萃,2014,14(9):1019-1021.

[15]趙昊云,張秦,吳元赭.妊娠合并急性胰腺炎的高危因素及預后評估[J].醫(yī)學研究生學報,2015,30(1):64-66.

[16]Avsar AF,Yildirim M,Cinkaya A.Unexpected fetal demise despite the reactive nonstress test during the conservative management of acute pancreatitis in pregnancy[J].Int J Surg Case Rep,2014,5(12):1047-1049.

[17]馬虹飛,宋蕾,邵長卿,等.實驗性重癥急性胰腺炎肺損傷中核因子-κB活化與細胞凋亡關系的研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2013,23(19):1-5.

[18]孟憲璞,閻文柱,單偉.N-乙酰半胱氨酸對急性胰腺炎模型大鼠的保護作用[J].中國組織工程研究,2015,13(5):759-765.

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The Etiology and Pathological Changes of Acute Pancreatitis in Pregnancy Rats

ZHANGXuana,LIUYib,LIBina,KELi-naa,WANGYing-lia,HUANGYa-xionga.

(a.DepartmentofGynecologyandObstetrics,b.DepartmentofUrology,DongfengGeneralHospital,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan442008,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the etiology and pathological changes of acute pancreatitis in pregnancy rats.MethodsFrom Feb.2013 to Jan.2015 from Dongfeng General Hospital Experimental Animal Center，48 sexually mature female SD rats and 24 male rats,according to male and female ratio 2∶1 were put into cage mate,recoding as day 1 of pregnancy on the discovery of vaginal suppository,and were equally divided into experimental group and control group of 24 rats according to random number table method.The control group after pregnancy received continuous free feeding,the experimental group was set up acute pancreatitis model on gestation day 7.After modeling of 6,12,24 h in the experimental group (control group at the corresponding time points),the lung wet weight index,lung histological scores,apoptosis of lung tissue,the bax and Bcl-2 mRNA levels were measured,and correlation analysis was conducted.ResultsCompared with the control group,pathologic examination revealed evident pancreatic tissue necrosis in the experimental group,inflammatory cell infiltration,suggesting successful modeling.Experimental lung wet weight coefficients and pathologic lung injury score at the time points were significantly increased than the control group(P<0.01).In the control group only a small amount of lung tissue apoptosis was seen,the experimental group was significantly higher than the control group(P<0.01).Bax and Bcl-2 mRNA expression of the control group was weak,while the experimental group was significantly increased than the control group at each time point(P<0.01).In the experimental group,Pearson correlation analysis showed that pathological score of lung injury,lung wet weight index and lung apoptosis index were positively correlated(P<0.05).ConclusionAcute pancreatitis during pregnancy in rats may lead to the occurrence and development of lung injury,and Bcl-2,bax gene expression changes are involved in the lung injury,and acute pancreatitis during pregnancy may be an important factor in promoting apoptosis in lung cells.

Key words:Acute pancreatitis; Pregnancy; Pathology; Lung injury; Rats

收稿日期：2015-07-07修回日期：2015-10-09編輯：伊姍

基金項目：湖北省教育廳科學技術研究項目(B20102106)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.23.040

中圖分類號：R463-4

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)23-4334-03