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    不同來源菌株固態(tài)發(fā)酵對(duì)紫麥麩皮酚酸釋放及抗氧化性能的影響

    2015-03-09 02:20:04孫盈乾張憲省董海洲侯漢學(xué)張錦麗
    中國食物與營養(yǎng) 2015年3期
    關(guān)鍵詞:麥麩麩皮總酚

    孫盈乾,張憲省,董海洲,侯漢學(xué),張錦麗

    (1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東泰安 271000;2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院,山東泰安 271000)

    生物活性物質(zhì)能降低一些慢性疾病發(fā)生率,并且有抗氧化活性。因此對(duì)果蔬、農(nóng)業(yè)工業(yè)廢渣中具有生物活性的酚類化合物的研究越來越深入。酚類結(jié)構(gòu)可以減緩或阻止氧化反應(yīng)的進(jìn)行[1]。由于彩色小麥麩皮中的酚酸大多數(shù)與纖維素木糖以酯鍵或醚鍵的形式相連[2],以結(jié)合態(tài)形式存在,可被酸堿或微生物分解[3-5]。I-Hsin Lee[6]等研究了絲狀真菌發(fā)酵黑豆,發(fā)酵黑豆的DPPH·清除能力、Fe2+螯合能力和還原能力均有所提高。Ming-Yen Juan[7]等選用枯草桿菌BCRC14715固態(tài)發(fā)酵黑豆,結(jié)果表明發(fā)酵提高了總酚和花青素含量、DPPH·清除能力、Fe2+螯合能力。K.Katina[8]等研究了酵母菌、乳酸菌及混合發(fā)酵對(duì)天然黑麥及發(fā)芽黑麥營養(yǎng)品質(zhì)的影響,研究結(jié)果表明,發(fā)芽后用啤酒酵母發(fā)酵能顯著提高游離酚酸的含量。

    目前國內(nèi)外的相關(guān)研究已顯示出固態(tài)發(fā)酵小麥麩皮、秸稈、豆類等能提高抗氧化性能。為提高彩麥麩皮的抗氧化能力,本文采用已從麩皮中中分離出菌種,用固態(tài)發(fā)酵的方法提高紫麥麩皮中的游離酚類物質(zhì)含量,以期找到能有效降解與多糖和木質(zhì)素相連的酯鍵或醚鍵,釋放出游離的酚類物質(zhì)的菌種,為微生物發(fā)酵麩皮及其在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 材料

    由肥城富士康面粉廠不同來源的麩皮中篩選出的霉菌13 株。其中Ⅰ:取自放置于陰暗屋內(nèi)尼龍袋中已發(fā)生自然霉變的麩皮;Ⅱ:取自背陰處墻角,有泥土處,散落的濕潤的麩皮;Ⅲ:取自水泥地路面處,自然堆積的麩皮;紫色小麥:濟(jì)南民天面粉有限公司。

    1.1.2 試劑

    木糖、三氯化鐵、地衣酚、DPPH、無水碳酸鈉、沒食子酸、乙醚、乙酸乙酯、正己烷、無水乙醇均為分析純。RP-HPLC 所用試劑為色譜純。

    1.2 主要儀器與設(shè)備

    M2e 多功能微孔板檢測(cè)儀 (USA,Molecular Devices);SHB 型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);DLSB-5 型低溫冷卻液循環(huán)泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);R-1001 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);高效液相色譜儀(LC-20AT 高壓泵),日本島津公司,島津色譜柱Inertsil ODS-SP (250 mm ×4.6 mm,5 μm)。

    1.3 試驗(yàn)方法

    紫色小麥麩皮:紫色小麥→脫皮→粉碎→過篩(40 目)→滅菌(100℃,15min)。

    1.3.1 麩皮的固態(tài)發(fā)酵

    從斜面保藏培養(yǎng)基上挑取幾環(huán)孢子于無菌水中,調(diào)整細(xì)胞個(gè)數(shù)為106個(gè)/mL。稱取適量麩皮,加入菌浮液于適宜溫度下發(fā)酵。發(fā)酵后的紫麥麩皮樣品于50℃烘箱中干燥,磨碎。

    1.3.2 總酚及酚酸的提取及測(cè)定

    (1)總酚及酚酸的提取

    總酚的提取。用80%的甲醇提取發(fā)酵后的紫麥麩皮,超聲輔助提取1h,離心。重復(fù)提取1 次。合并上清液,濃縮至無醇,用甲醇定容至10mL。

    酚酸的提取。發(fā)酵后的紫麥麩皮中加入正己烷,超聲輔助脫脂1h,離心。重復(fù)脫脂1 次,用甲醇提取脫脂后的紫麥麩皮,合并上清液,濃縮至無醇,用鹽酸調(diào)節(jié)pH 為2,用等體積乙醚/乙酸乙酯萃取3 次,合并有機(jī)相于40 ℃濃縮干燥,色譜甲醇復(fù)溶后得游離型酚酸。

    (2)總酚含量的測(cè)定

    100μL 總酚溶液中加入6mL 蒸餾水,渦旋震蕩5s,靜置1~8min;加入1.5mL Na2CO3溶液,加蒸餾水定容到10mL。室溫避光條件下,將密封的試管靜置2h;765nm 下測(cè)定吸光度。以空白試劑做參比,沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)確定回歸方程為y=0.116 8x-0.005 32,相關(guān)系數(shù)R2=0.997 5,其中x:沒食子酸濃度(μg/mL)。

    (3)DPPH·清除率

    取總酚溶液0.1mL 加3.9mL 6×10-5mol/L DPPH 溶液,室溫黑暗下反應(yīng)60min。然后在517nm 處,測(cè)定0和60min 時(shí)的吸光度。

    (4)酚酸組成

    色譜條件:流動(dòng)相為A—水/冰醋酸(0.5%,v/v);B—乙腈/冰醋酸(0.5%,v/v)。梯度洗脫為0~20 min,B 為10% ;20~30 min,B 為10%~50% ;30~40 min,B為50%~100% ;40~45min,B 為100%~10%。進(jìn)樣量為20μL;進(jìn)樣前酚酸溶液均用0.45μm 微孔濾膜過濾。定性定量方法為保留時(shí)間和最大吸收波長定性,外標(biāo)法定量。

    圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品的RP-HPLC 譜圖(280 nm)

    將酚酸標(biāo)準(zhǔn)品按一定濃度溶于乙腈中,制得11 種標(biāo)準(zhǔn)品的混合標(biāo)樣,進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè),確定其保留時(shí)間及分離效果。所得標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖如圖1 所示。將11 種標(biāo)準(zhǔn)品按一定倍數(shù)稀釋,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,所得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)列于表1 中。

    表1 11 種標(biāo)準(zhǔn)樣品的相關(guān)性系數(shù)

    1.3.3 水溶性阿拉伯木聚糖的測(cè)定

    取100mg 發(fā)酵后的紫麥麩皮,加入10mL 水,30℃振蕩2h,離心;取1mL 上清液,加入1mL 4 mol/L 的HCl,在密封的試管內(nèi)100℃保持2h,冷卻;取1 mL 加入到試管,加入2mL 水,3mL FeCl3和0.3mL 地衣酚;沸水浴加熱30min,取出后加入蒸餾水到10mL,冷卻;670 nm 下測(cè)吸光度。以空白試劑做參比,木糖為標(biāo)準(zhǔn)品,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)確定回歸方程為y=0.54x-0.002,相關(guān)系數(shù)R2=0.998,其中x:木糖濃度(mg/mL)。

    1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析(ANOVA)和Duncan 多重比較法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(α<0.05),所有測(cè)定重復(fù)3 次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 霉菌發(fā)酵紫麥麩皮的總酚含量

    Ⅱ-M1 對(duì)總酚含量的釋放效果較好(圖2)。由樣本Ⅱ篩選出的霉菌發(fā)酵紫麥麩皮后的總酚含量沒有顯著性差異。樣本Ⅰ篩選出的霉菌發(fā)酵紫麥麩皮后的總酚含量差異顯著。

    霉菌固態(tài)發(fā)酵紫麥麩皮后的總酚含量增加,這一結(jié)果與Dordevic 等[9]、JEFFREYMOORE 等[10]的研究結(jié)果一致。紫色小麥麩皮中加入霉菌的菌懸液固態(tài)發(fā)酵,可以斷裂與酯類連接的酯鍵或醚鍵,使酚類物質(zhì)由結(jié)合型變?yōu)橛坞x型,含量增加。麩皮中加入霉菌,在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源性的酶類,使麩皮的細(xì)胞壁發(fā)生降解,釋放出更多的酚類化合物。

    圖2 霉菌發(fā)酵對(duì)紫麥麩皮總酚含量的影響

    2.2 霉菌發(fā)酵紫麥麩皮的DPPH·清除率

    由圖3 可以看出,Ⅱ-M1、Ⅲ-M6 固態(tài)發(fā)酵紫色小麥麩皮后的DPPH·清除率的增加較為顯著。Ⅱ、Ⅲ來源篩選出的霉菌固態(tài)發(fā)酵紫麥麩皮后的DPPH·清除率差異顯著。

    圖3 霉菌發(fā)酵紫麥麩皮的DPPH·清除率

    霉菌固態(tài)發(fā)酵紫色小麥麩皮后的DPPH·清除率均有一定程度的提高,霉菌最高增加了0.33 倍。紫麥麩皮中總酚含量與DPPH·清除率增加程度并不是一致的。DPPH·清除率大小可能是多種生物活性成分協(xié)同作用的結(jié)果,在發(fā)酵過程中,微生物作用于麩皮中,除了釋放出游離的酚酸外、還釋放出了類黃酮、木酚素等化合物,用FC 法測(cè)定出的是酚類化合物的含量,而DPPH·的清除并不是這些酚類化合物作用簡單加和的結(jié)果。研究表明,酚酸[11]和類黃酮[12]有一定的清除自由基的效果。

    2.3 霉菌發(fā)酵紫麥的酚酸組成

    由表1 可以看出,霉菌發(fā)酵紫麥麩皮后,麩皮中游離型酚酸以阿魏酸為主。異阿魏酸和水楊酸的含量次之,原兒茶酸和丁香酸均可檢測(cè)到,但是含量相對(duì)較低。部分菌株發(fā)酵后,沒有檢測(cè)到?jīng)]食子酸和對(duì)羥基苯甲酸。其中第Ⅱ-M1、Ⅲ-M5 株菌發(fā)酵后釋放出的酚酸含量相對(duì)較高,達(dá)到了2 600μg/g 麩皮以上。

    固態(tài)發(fā)酵后釋放出的酚酸以阿魏酸為主約占酚酸總量的50%~91%,其次主要是對(duì)香豆酸、異阿魏酸,這說明固態(tài)發(fā)酵對(duì)羥基肉桂酸的衍生物的釋放效果較好??偟膩碚f,肉桂酸類酚酸的含量高于苯甲酸類的酚酸。與丁巖[13]關(guān)于紫麥麩皮游離中酚酸組成的研究結(jié)果相比,發(fā)酵后阿魏酸的含量顯著提高,檢測(cè)到?jīng)]食子酸、異阿魏酸和水楊酸。

    表2 霉菌發(fā)酵紫麥麩皮的游離酚酸組成(μg/g 脫脂麩皮)

    2.4 霉菌發(fā)酵紫麥麩皮的可溶性阿拉伯木聚糖含量

    由圖4 可以看出,霉菌發(fā)酵后可溶性阿拉伯木聚糖提取率一定程度的降低,這可能是因?yàn)槊咕诠虘B(tài)發(fā)酵過程中,能夠較大程度的以阿拉伯木聚糖作為碳源生長。

    麩皮發(fā)酵過程中內(nèi)部結(jié)構(gòu)變的疏松,易于水溶性阿拉伯木聚糖的溶出。阿拉伯木聚糖與羥基肉桂酸等通過酯鍵、醚鍵形成酯類、醚類,在發(fā)酵過程中,酯鍵、醚鍵斷裂,酚酸和可溶性阿拉伯木聚糖被釋放,微生物維持自身生長的需要,可利用的營養(yǎng)成分已經(jīng)基本消耗殆盡時(shí),利用了一部分釋放出的可溶性阿拉伯木聚糖,使發(fā)酵后總酚含量高的菌株,可溶性阿拉伯木聚糖含量反而相對(duì)較低。

    3 結(jié)論

    圖4 霉菌固態(tài)發(fā)酵紫麥麩皮的可溶性阿拉伯木聚糖含量

    適宜條件下固態(tài)發(fā)酵彩麥麩皮是提高游離酚酸含量有效的方法,不同種類菌株的發(fā)酵效果各不相同。選用適當(dāng)?shù)木臧l(fā)酵,對(duì)提高酚酸釋放及抗氧化能力有重要的意義。實(shí)驗(yàn)室篩選出的霉菌固態(tài)發(fā)酵紫麥麩皮后,研究總酚含量、DPPH·清除率、酚酸組成以及可溶性阿拉伯木聚糖含量。不同菌株固態(tài)發(fā)酵的試驗(yàn)結(jié)果表明,霉菌的發(fā)酵效果最好,霉菌Ⅳ-11 固態(tài)發(fā)酵紫麥麩皮后,具有較好的酚酸釋放及抗氧化能力。霉菌Ⅳ-11 發(fā)酵后總酚含量為3.55mg/g 麩皮,DPPH·清除率為51%,酚酸含量為2 922μg/g 麩皮。

    不同來源麩皮篩選出的菌株及同一來源麩皮中篩選出的菌株固態(tài)發(fā)酵紫麥麩皮的結(jié)果呈現(xiàn)出差異性,這體現(xiàn)了不同的微生物群落對(duì)底物的利用有不同的特征。固態(tài)發(fā)酵有利于酚酸的釋放及抗氧化能力的提高,但菌株選擇不恰當(dāng)會(huì)使酚酸含量降低,Jose Antonio Curiel[14]用乳酸菌發(fā)酵食品,酚酸含量降低。固態(tài)發(fā)酵過程中,發(fā)酵菌株的選擇非常重要。

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